PFOS處理渦蟲后hsp90基因體現(xiàn)水平檢測

指導(dǎo)教師：袁佐清學(xué)生姓名：李碩

1/23主要內(nèi)容一、課題背景和意義二、試驗材料、試劑和儀器三、試驗內(nèi)容四、成果與分析五、總結(jié)2/23課題背景意義

PFOS全氟辛烷磺酸是一種持久性有機(jī)污染物，其具有長期殘留性、生物蓄積性、半揮發(fā)性和高毒性，能夠在大氣環(huán)境中長距離遷移并能沉積回地球，對人類健康和環(huán)境具有嚴(yán)重危害天然或人工合成有機(jī)污染物質(zhì)。渦蟲作為研究細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)模式動物已有200數(shù)年歷史。而當(dāng)代原位雜交技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、流式細(xì)胞儀分選技術(shù)等先進(jìn)研究伎倆在渦蟲研究中應(yīng)用,以及渦蟲基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究開展,使渦蟲這一古老模式生物重新煥發(fā)新生命力。研究發(fā)覺,渦蟲許多基因與高等動物中有關(guān)基因同源性很高。因此,對低等無脊椎動物渦蟲再生機(jī)理研究,有助于說明高等動物細(xì)胞分化調(diào)控及神經(jīng)再生分子機(jī)制,也可為人類有關(guān)疾病治療和干細(xì)胞應(yīng)用提供有價值線索。

3/23試驗材料、試劑和儀器一、材料：東亞三角渦蟲二、試劑：全氟辛烷磺酸、去離子水、蒸餾水、氯仿、25%乙醇、異丙醇、buffer、DNaseI、dNTP、Taq酶、引物、EB試劑、Reagent試劑、模版cDNA、mark等三、試驗儀器：離心機(jī)、PCR儀、Gel-PROANALYZER凝膠定量分析軟件，Excel4/23試驗流程取材和預(yù)制備提取渦蟲總RNARNA檢測總RNA反轉(zhuǎn)錄

cDNA檢測數(shù)據(jù)分析RT-PCR檢測5/23試驗辦法一、取材及預(yù)制備從山東魯中地域采取野生性成熟東亞三角渦蟲，飼養(yǎng)于涼開水中，一周之內(nèi)不投任何餌料，使之排空消化道內(nèi)食物。選6個培養(yǎng)皿，分別配備0、0.5、1、5、15、30mg/l六個濃度PFOS溶液，選擇大小形態(tài)基本相同渦蟲120條，分別飼養(yǎng)于6個培養(yǎng)皿中。試驗中所用渦蟲為上述條件下處理1、4、10天渦蟲。6/23二、提取渦蟲總RNA

用TaKaRaRNAisoReagent提取渦蟲成體總RNA。提取總RNA過程中所用器皿均用DEPC處理后高壓滅菌，或180°C烘烤10h。(1)取數(shù)條成體東亞三角渦蟲，置于盛有液氮研缽中以最大速度進(jìn)行研磨后，按50-100mg渦蟲每毫升RNAisoReagent試劑百分比，加入RNAisoReagent。(2)將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5min，4°C12023rpm離心5min，取上清。(3)根據(jù)上清液體積按每毫升上清加入0.2ml氯仿百分比加入氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩，待溶液呈乳白色后，室溫靜置5min。12023rpm，4°C離心15min。離心后，混合物分為三相：下層紅色氯仿相，上層無色水相以及中間相。(4)小心地將上層無色水相轉(zhuǎn)移至另一種離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒充足混勻，室溫靜置10min后，12023rpm，4°C離心10min。(5)小心移去上清液，加入1ml75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，切勿觸及沉淀。12023rpm，4°C離心5min，棄去上清。(6)干燥器內(nèi)干燥RNA沉淀15min，用不含RNA酶滅菌水（DEPC處理）溶解RNA。用核酸分析儀測定所得總RNA濃度，凍存于-70°7/23

三、RNA檢測（瓊脂糖凝膠電泳）（1）1%瓊脂糖凝膠電泳凝膠配制：稱取瓊脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml10×MOPS緩沖液和39.5mlDEPC水，放微波爐里溶化。待冷卻到60攝氏度左右時，加入1ml甲醛，搖勻（避免產(chǎn)氣憤泡）。倒入凝膠板上凝固30min。（2）取各個RNA樣品4μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2μl混勻，加入變性膠加樣孔中。（3）90V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀測，照相保存。（4）若見28S和18S兩條明亮條帶，則無DNA條帶污染。8/23三、渦蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄使用ReverseTranscriptaseM-MLV（購自Promega公司）進(jìn)行渦蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。試驗中所有器皿均用DEPC處理并通過高壓滅菌處理。能夠?qū)?ng-1μg總RNA或polyA+RNA反轉(zhuǎn)錄為RNA-Ready第一鏈cDNA。(1)在0.2ml離心管內(nèi)將下列成份混合：2μlRNAsample和2.5μlOligo(dT)primer（50μM)(2)加2.5μl滅菌水，使每個反應(yīng)終體積至7μl。(3)混勻各成份，短暫離心。(4)70°C溫育10min。(5)冰上急冷2min。(6)向每個離心管中加入下列成份（已有7μl）：

2μl5×M-MLVBuffer0.25μlRNaseInhibitor（40U/μl）

2μldNTPMix（2.5mM）

0.75μlReverseTranscriptaseM-MLV（200U/μl）

12μlTotalvolume(7)混勻反應(yīng)物。(8)短暫離心，搜集反應(yīng)物于管底。37°C溫育10min。(9)42°C溫育1h。(10)70°C溫育15min，終止反應(yīng)，然后冰上冷卻。(11)得到cDNA.。樣品于-20°C保存。9/23·四、cDNA檢測

以渦蟲EF2α基因作為內(nèi)參。檢測反應(yīng)體系為：10×buffer：2.5μldNTPmix：2

lβ-actinsenseprimer:0.25

l(20UM)β-actinanti-senseprimer:0.25

l(20UM)Taq酶：0.125μlcDNA：0.4μlH2O：19.475μlTotal25

lPCR反應(yīng)條件為：1cycle:94°C5min(預(yù)變性)30°Ccycles:94°C30sec(變性)5230sec(退火)72°C1min(延伸)1cycle:72°C10min(最后延伸)取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。若僅有特異性目標(biāo)片段，則說明無基因組DNA污染，該模板cDNA能夠用于Real-timePCR分析；若有非特異性片段擴(kuò)增，則說明基因組DNA消除不徹底，需對RNA深入消化然后重新反轉(zhuǎn)錄。10/23五、RT-PCR檢測

取0.2ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，對應(yīng)cDNA各1ul。一管中不加模板用作陰性對照。各管補(bǔ)加水至25ul。

混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預(yù)變性后，95℃15s→65℃35s（熒光檢測），40cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴(kuò)增設(shè)成一種溫度，只在擴(kuò)增出現(xiàn)問題時才會考慮設(shè)梯度。11/23六、數(shù)據(jù)分析利用Gel-PROANALYZER凝膠定量分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。12/23成果與分析一、PFOS處理一天渦蟲后hsp90基因體現(xiàn)檢測1.PFOS處理一天后渦蟲hsp90基因體現(xiàn)電泳圖片

注:圖像從左向右分別是mark、0、0.5、1、5、15、30mg/L處理一天渦蟲Hsp90基因電泳跑膠成果13/23儀器分析得數(shù)據(jù)14/232、與內(nèi)參比較及計算數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)計算

討論：通過計算得出上述表3數(shù)據(jù)，我們能夠看出濃度越高，渦蟲hsp90基因體現(xiàn)就越活躍，根據(jù)熱休克蛋白性質(zhì)可知，在短時間內(nèi)PFOS濃度越高渦蟲應(yīng)激反應(yīng)就越強(qiáng)，hsp90基因體現(xiàn)就越顯著。15/23二、PFOS處理四天渦蟲后Hsp90基因體現(xiàn)檢測1、PFOS處理四天后渦蟲hsp90基因體現(xiàn)分析數(shù)據(jù)

注：圖像從右向左分別是mark、0、0.5、1、5、15、30mg/L處理四天渦蟲Hsp90基因電泳跑膠成果16/23儀器分析得出數(shù)據(jù)：17/232、與內(nèi)參比較及計算數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)計算成果

討論：根據(jù)上述表6數(shù)據(jù)我們能夠發(fā)覺，通過四天處理渦蟲也許已經(jīng)部分死亡，在一定程度不符合熱休克蛋白應(yīng)當(dāng)體現(xiàn)出來特性，由此發(fā)覺通過四天培養(yǎng)，PFOS毒性對渦蟲生存已經(jīng)產(chǎn)生影響。18/23三、PFOS處理十天渦蟲后Hsp90基因體現(xiàn)檢測1、PFOS處理十天后渦蟲hsp90基因體現(xiàn)電泳圖片

注：圖像從左向右分別是mark、0、0.5、1、5、15、30mg/L處理十天渦蟲Hsp90基因電泳跑膠成果19/23儀器分析得出數(shù)據(jù)20/232.與內(nèi)參比較及計算數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)計算成果討論：根據(jù)上述表9數(shù)據(jù)，我們顯著看出，已有部分濃度培養(yǎng)下渦蟲所有死亡，不過我們顯著看出，濃度越高渦蟲hsp90基因體現(xiàn)越少，說明高濃度下長時間處于PFOS溶液培養(yǎng)下，渦蟲機(jī)制已經(jīng)無法抵抗這種毒性而所有死亡。21/23總結(jié)通過試驗我們得出下列結(jié)論：1.在一定時間內(nèi)PFOS濃度與渦蟲hsp90基因體現(xiàn)成正比，渦蟲受到刺激越大，對本身保護(hù)機(jī)制反應(yīng)越強(qiáng)烈，詳細(xì)體現(xiàn)為hsp90基因體現(xiàn)量增加。2.一定濃度PFOS下，在渦蟲可受范圍內(nèi)，渦蟲hsp90基因仍然體現(xiàn)，不過超出一定濃度，渦蟲就會死亡。3.試驗意義在于我們能從分子水平去解釋PFOS對渦蟲hsp90基因毒理影響，由此我們能夠延伸到很多方面去研究，對后來我們研究類似問題提供了切實可行辦法。4.試驗雖然基本成功，不過仍然存