cody在單核細(xì)胞增生李斯特菌鞭毛運(yùn)動(dòng)和毒力方面的作用

cod是一個(gè)廣泛存在于低g-c含量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的全面隨機(jī)因素。它可以調(diào)節(jié)碳代謝、氮代謝、氨基酸生物合成、外層因子運(yùn)輸和分解、抗生素合成、鞭毛和早芽形成等代謝途徑和細(xì)胞生理過(guò)程。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是革蘭氏陽(yáng)性食源性致病菌。由Lm引起的疾病稱(chēng)為李斯特菌病,其主要的癥狀為腦膜炎和敗血癥,以及孕婦流產(chǎn)。因其高致死率(20%~30%感染者死亡)而被世界衛(wèi)生組織(WHO)列入四大食源性致病菌之一本研究通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建了CodY缺失突變株EGDeΔcodY以及高拷貝質(zhì)粒表達(dá)回復(fù)菌株EGDeΔcodY+pERL3-codY;比較分析了野生株EGDe、EGDeΔcodY和EGDeΔcodY+pERL3-codY三種菌株的鞭毛運(yùn)動(dòng)能力、與鞭毛運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、細(xì)菌溶血活性及主要毒力因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異,從而深入探討CodY對(duì)Lm鞭毛運(yùn)動(dòng)和毒力因子調(diào)控的分子機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1蘑菇和顆粒1.2egdeco公共資源不足1.2.1cogy失去了突變菌株的結(jié)構(gòu)首先采用SOEingPCR1.2.2ej基因的重組表達(dá)質(zhì)粒以EGDe基因組DNA為模板使用引物對(duì)P7/P8擴(kuò)增出C片段(包含codY基因ORF和啟動(dòng)子在內(nèi)的1739bp片段),XholI和BamHI雙酶切后,將C片段連接到多拷貝質(zhì)粒pERL3上,構(gòu)建codY基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pERL3-codY。然后將其電轉(zhuǎn)入EGDeΔcodY感受態(tài)細(xì)胞中,使用引物對(duì)P9/P10進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證。1.3菌液制備及od測(cè)定挑取待測(cè)菌株的單克隆于5mlBHI(BrainHeartInfusion,購(gòu)自B&D公司)培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),第二天,取其1ml接入新鮮的100mlBHI培養(yǎng)中,混勻后,采用分光光度計(jì)(EppendorfBioPhotometerPlus)測(cè)定菌液此時(shí)的OD1.4關(guān)于細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)1.4.1菌液穿刺培養(yǎng)采用半固體瓊脂穿刺法觀(guān)察細(xì)菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)性:用直的接種針蘸取少量過(guò)夜活化的菌液(25℃,180r/min震蕩培養(yǎng))穿刺接種于BHI半固體培養(yǎng)基(0.5%的瓊脂)中,25℃靜置培養(yǎng)一周,每天拍照記錄。如果細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中能擴(kuò)散形成倒傘狀結(jié)構(gòu),則判定該細(xì)菌鞭毛具有運(yùn)動(dòng)性。1.4.2細(xì)菌鞭毛扁平運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)將待測(cè)菌株過(guò)夜活化(25℃,180r/min震蕩培養(yǎng)),取1μl菌液點(diǎn)樣于BHI半固體平板(0.3%瓊脂)上1.4.3關(guān)于赫特-pcr檢測(cè)、鞭毛形成和運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)移和發(fā)現(xiàn)將待測(cè)菌液培養(yǎng)到對(duì)數(shù)前期OD1.5細(xì)菌毒劑1.5.1細(xì)菌溶血活性檢測(cè)參照于新惠等1.5.2細(xì)菌對(duì)棉扇蟲(chóng)的毒性實(shí)驗(yàn)將待測(cè)菌液培養(yǎng)到OD2結(jié)果2.1egdeco公共資源不足2.1.1egdecody缺失片段的構(gòu)建如圖1所示,用codY基因兩端以引物對(duì)P5/P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以EGDeΔcodY為模板所得片段比以EGDe基因組為模板短約330bp,其長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果一致,表明EGDeΔcodY成功缺失了codY基因,同時(shí)DNA測(cè)序也進(jìn)一步驗(yàn)證了EGDeΔcodY構(gòu)建成功。2.1.2以perl3-cody為模板的片段與以perl3-cody重組質(zhì)粒的片段的比較如圖2所示,用pERL3質(zhì)粒兩端引物對(duì)P9/P10進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以EGDeΔcodY+pERL3-codY為模板所得片段與以pERL3-codY重組質(zhì)粒為模板所得片段大小一致(2089bp),與預(yù)期結(jié)果相符。表明pERL3-codY重組質(zhì)粒已成功電轉(zhuǎn)入EGDeΔcodY感受態(tài)細(xì)胞中,EGDeΔcodY+pERL3-codY回復(fù)突變株構(gòu)建成功。2.2egdecody和egdecody生長(zhǎng)階段的差異如圖3所示,在營(yíng)養(yǎng)豐富的BHI培養(yǎng)基中,三種菌株生長(zhǎng)快速且生物量較高。與野生型菌株EGDe相比,EGDeΔcodY在對(duì)數(shù)中期生長(zhǎng)較慢,在對(duì)數(shù)前期和穩(wěn)定期的生長(zhǎng)狀況并無(wú)顯著差異,而EGDeΔcodY+pERL3-codY與EGDeΔcodY的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致,并未回復(fù)到野生型水平,推測(cè)pERL3為多拷貝的表達(dá)質(zhì)粒,CodY的過(guò)量表達(dá)可能會(huì)影響細(xì)菌中某些氨基酸的合成,從而對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響。2.3cod缺乏影響了單核細(xì)胞增多和李鞭毛運(yùn)動(dòng)以及鞭毛相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)2.3.1種菌株鞭毛生長(zhǎng)的運(yùn)動(dòng)性如圖4a所示,在BHI半固體培養(yǎng)基中,EGDe、EGDeΔcodY和EGDeΔcodY+pERL3-codY都能形成倒傘狀結(jié)構(gòu),三種菌株的鞭毛均具有運(yùn)動(dòng)性;如圖4b和表2所示,在含0.3%瓊脂的BHI半固體平板培養(yǎng)48h后,與EGDe相比,EGDeΔcodY在平板上泳動(dòng)所形成圓圈的直徑顯著變小,EGDeΔcodY+pERL3-codY菌株所形成的直徑大小與野生型菌株基本一致。以上結(jié)果表明CodY的缺失降低了細(xì)菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)性。2.3.2egdecody+pe基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)挑選與鞭毛形成和運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因motB、motA、fliE、flhA、fliP進(jìn)一步做RT-qPCR檢測(cè),motA和motB是與鞭毛運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因,而fliE、flhA和fliP是與鞭毛結(jié)構(gòu)形成相關(guān)的基因。結(jié)果如圖5所示,與野生型菌株EGDe相比,motA、motB、fliE在EGDeΔcodY中表達(dá)量顯著降低,fliP在EGDeΔcodY中表達(dá)量顯著升高。除flip外,其它與鞭毛運(yùn)動(dòng)和形成相關(guān)的基因在EGDeΔcodY+pERL3-codY中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均基本回復(fù)到野生型菌株的水平。以上結(jié)果表明,缺失CodY后,motA和motB的表達(dá)量下降,其鞭毛運(yùn)動(dòng)性降低;但與鞭毛結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因fliE的表達(dá)量顯著下降,flhA基本不變,fliP的表達(dá)量卻極大升高,暗示CodY缺失對(duì)鞭毛形成的影響較為復(fù)雜,對(duì)不同基因的調(diào)控途徑可能不同,但總體來(lái)說(shuō),CodY的缺失能降低鞭毛的運(yùn)動(dòng)性。2.4cod對(duì)單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞增生詩(shī)意菌毒力的影響2.4.1egdecody基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)如前所述,在Lm中,PrfA能調(diào)控絕大多數(shù)毒力因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá),細(xì)菌溶血活性蛋白(LLO)是Lm中最主要的毒力因子之一。為探究CodY對(duì)Lm毒力的影響,我們比較了PrfA的編碼基因prfA和溶血素LLO的編碼基因hly在三種菌株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果如圖6所示,與野生型菌株EGDe相比,prfA和hly在EGDeΔcodY中的表達(dá)量顯著降低,表明codY基因的缺失可能導(dǎo)致EGDeΔcodY菌株的細(xì)菌毒力降低。但有趣的是,prfA和hly在EGDeΔcodY+pERL3-codY中的表達(dá)量并沒(méi)有如預(yù)期一樣回復(fù)到野生株水平,反而比CodY缺失株更為降低,暗示CodY對(duì)細(xì)菌毒力的調(diào)控可能與其表達(dá)量相關(guān),由于我們所用的回復(fù)表達(dá)質(zhì)粒為多拷貝質(zhì)粒,回復(fù)菌株中CodY蛋白的過(guò)量表達(dá)可能會(huì)抑制prfA和hly的表達(dá)。2.4.2y+perl3-cody中的活性差異為了從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證codY基因的缺失將導(dǎo)致細(xì)菌毒力的降低,我們比較了細(xì)菌溶血素在EGDe、EGDeΔcodY和EGDeΔcodY+pERL3-codY中的活性差異。結(jié)果如圖7所示,隨著菌液量的增加,細(xì)菌中LLO的濃度升高,溶血活性也隨之上升,當(dāng)菌液量為30μl、50μl、100μl時(shí),與野生型菌株EGDe相比,EGDeΔcodY和EGDeΔcodY+pERL3-codY的溶血活性顯著性降低,此結(jié)果與hly轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果一致,表明codY基因的缺失能導(dǎo)致Lm主要毒力基因hly轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的下降,從而導(dǎo)致Lm毒力降低。2.4.3細(xì)菌侵蝕棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力以上結(jié)果表明,codY基因的缺失能夠?qū)е翷m毒力降低。為從活體水平更進(jìn)一步確證該結(jié)論,我們開(kāi)展了細(xì)菌侵染棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力實(shí)驗(yàn)。如實(shí)驗(yàn)方法所述,我們分別將同等劑量(菌液體積和菌液數(shù)目)的EGDe、EGDeΔcodY和EGDeΔcodY+pERL3-codY注射入生理狀態(tài)一致的5齡棉鈴蟲(chóng)腹部,以同等劑量的PrfA蛋白組成性高表達(dá)突變株prfA3缺乏cody后細(xì)菌毒力基因表達(dá)的改變?nèi)中赞D(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY廣泛存在于低G+C含量的革蘭氏陽(yáng)性菌中,它能參與細(xì)菌許多生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)(如氨基酸合成與轉(zhuǎn)運(yùn)、糖代謝、鞭毛運(yùn)動(dòng)、毒力等)。我們的實(shí)驗(yàn)證明缺失CodY后,與鞭毛運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)的基因motA和motB的表達(dá)量顯著降低,該結(jié)果與CodY缺失菌株在軟瓊脂上運(yùn)動(dòng)性降低相一致;而fliE和flip都是與鞭毛結(jié)構(gòu)形成相關(guān)的基因,主要是參與鞭毛的基體(basalbody)和鉤形鞘(hook)的形成。在很多細(xì)菌(如大腸桿菌)中,與鞭毛結(jié)構(gòu)形成相關(guān)的基因(如fliE、fliP、flhA和flhB)和與鞭毛運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)的基因(如motA、motB、flgMN、fliDST)位于不同的操縱子上并受到不同的sigma因子的調(diào)控CodY能參與細(xì)菌(如枯草芽孢桿菌)毒力基因的表達(dá)調(diào)控。我們的實(shí)驗(yàn)證明缺失CodY后