基因工程lpcr技術(shù)基因工程lpcr技術(shù)第1頁一、PCR技術(shù)誕生與發(fā)展聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR

）又稱為PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一個(gè)高效、快速、特異性體外DNA聚合程序。1985年，美國PE-cetus企業(yè)人類遺傳研究室KaryMullis創(chuàng)造了含有劃時(shí)代意義PCR技術(shù)；1988年，美國PE-cetus企業(yè)推出世界上第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR反應(yīng)自動(dòng)化；1993年，KaryMullis因創(chuàng)造PCR技術(shù)取得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；1995年，定量PCR儀誕生，使定量研究DNA靶序列成為現(xiàn)實(shí)?；蚬こ蘬pcr技術(shù)第2頁定義：在體外無細(xì)胞體系中模擬天然DNA復(fù)制過程使目標(biāo)DNA量增加反應(yīng)。二、原理基因工程lpcr技術(shù)第3頁循環(huán)

denature94C30S

annealingTm-5C

elongate72C

cycle25-35基因工程lpcr技術(shù)第4頁三、PCR反應(yīng)成份1、引物(Primer):15-30nt設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)*引物間---ACGC---GAGC*引物內(nèi)--AACTGTT--*GC%*末端保守性*吞并堿基2、Taq酶基因工程lpcr技術(shù)第5頁DNA聚合酶對(duì)PCR準(zhǔn)確性主要影響DNA聚合酶保真性主要取決于其3’→5’核酸外切酶活性，它負(fù)責(zé)對(duì)錯(cuò)誤摻入堿基進(jìn)行校正。相關(guān)研究結(jié)果表明，DNA聚合酶犯錯(cuò)率在每輪延伸每核苷酸1.6X10–6-2.1X10–4范圍內(nèi)。DNA聚合酶堿基摻入錯(cuò)誤可能發(fā)生在其延伸階段五種活性：與dNTP結(jié)合特異性磷酸二酯鍵形成速率焦磷酸釋放速率堿基錯(cuò)誤摻入之后連續(xù)延伸性3’→5’核酸外切活性強(qiáng)弱基因工程lpcr技術(shù)第6頁用于PCRDNA聚合酶介紹KlenowThermusaquaticus72C35-100nt/s/molThelargespringabove,nearGreatFountainGeyser,Yellowstone,wasthesourceofthecultureofThermusAquaticus<Taq>,discoveredbyThomasBrock,U.Wisconsinin1968).

基因工程lpcr技術(shù)第7頁TaqDNA酶聚合犯錯(cuò)率較高（2.1X10-4），因?yàn)樗鼪]有3’→5’核酸外切酶活性和校正功效。然而經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使Taq酶聚合犯錯(cuò)率降低到原來1/3。TaqDNA聚合酶催化聚合反應(yīng)可能性，則TaqDNA酶還經(jīng)常造成擴(kuò)增產(chǎn)物缺失突變。TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus）普遍錯(cuò)誤類型是由AT轉(zhuǎn)換為GC；假如模板DNA含有形成二級(jí)結(jié)構(gòu)防止稀釋保留TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在室溫下也含有延伸引物活性

(HotStart)TaqDNA酶在使用時(shí)應(yīng)注意：基因工程lpcr技術(shù)第8頁用于PCRDNA聚合酶介紹KlenTaqDNA聚合酶是一個(gè)N端缺失了TaqDNA聚合酶，因而沒有5’核酸外切酶活性；KlenTaqDNA聚合酶Mg2+最正確濃度范圍很寬，所以很輕易優(yōu)化KlenTaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus）

在最正確反應(yīng)條件下，KlenTaqDNA聚合酶犯錯(cuò)率為5.1X10–5，性能略優(yōu)于TaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件；基因工程lpcr技術(shù)第9頁用于PCRDNA聚合酶介紹

TthDNA聚合酶在Mn2+存在下，能有效地反轉(zhuǎn)錄長度在1000堿基以下RNA；

TthDNA聚合酶在Mg2+存在下，能由DNA模板合成DNA；

TthDNA聚合酶（Thermusthermophilus）好地克服RNA鏈中普遍存在二級(jí)結(jié)構(gòu)難題。

TthDNA聚合酶在較高溫度下仍含有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，所以能很

基因工程lpcr技術(shù)第10頁用于PCRDNA聚合酶介紹

Pfu是一個(gè)高保真DNA聚合酶，犯錯(cuò)率極低；

PfuDNA聚合酶擴(kuò)增出產(chǎn)物帶有平頭末端；

PfuDNA聚合酶擴(kuò)增速度極快，達(dá)1.5-2kb/min；PfuDNA聚合酶（Pyrococcusfuriosus）

PfuDNA聚合酶熱穩(wěn)定性很高。

7.0X10–7-1.6X10–6基因工程lpcr技術(shù)第11頁用于PCRDNA聚合酶介紹

VentDNA聚合酶含有3’→5’核酸外切酶活性和校正功效，所以與其它DNA聚合酶（如Taq酶）相比，含有相對(duì)很好高保真性，其犯錯(cuò)率為2.4X10–5-5.7X10–5

；

VentDNA聚合酶（Thermococcuslitoralis）度小于2kb時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度與Mg2+濃度并無關(guān)聯(lián)；

假如擴(kuò)增加度大于2kb，則需要高于2mMMg2+，而在擴(kuò)增加

假如模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷，VentDNA聚合酶不能延伸引物。

基因工程lpcr技術(shù)第12頁3、Mg2+4、模板(Template)制備和用量

100bp~40kb實(shí)際<3~5k難于得到長擴(kuò)增產(chǎn)物原因：*3’錯(cuò)配*高溫下脫嘌呤(depurination)或脫嘧啶(deamination)-Taq不能經(jīng)過pH7.0100°C1/100kb/mindepu-pH6.451/20~30kb/min*反應(yīng)添加劑、PCR循環(huán)參數(shù)、模板完整性*Taq酶自動(dòng)脫落改進(jìn)方法:*發(fā)展新酶（pfu、Vent&雙聚合酶-消除錯(cuò)配）or合成能力強(qiáng)酶(Tth)*Tricine（三羥甲基甘胺酸）-pH穩(wěn)定性基因工程lpcr技術(shù)第13頁5、PCRbufferTris.Cl、KCl6、dNTP20-200mol/L四、平臺(tái)效應(yīng)：PCR反應(yīng)后期循環(huán)產(chǎn)物對(duì)數(shù)累積趨于飽和，伴隨0.3~1pmol靶序列增加。*dNTP和引物快速摻入，濃度降低*酶與模板百分比下降*變性溫度高和溫度循環(huán)，酶活力和dNTP穩(wěn)定性下降*非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物競(jìng)爭(zhēng)*產(chǎn)物在高濃度時(shí)變性不完全，影響引物延伸*酶與PCR產(chǎn)物結(jié)合，使酶濃度下降基因工程lpcr技術(shù)第14頁五、PCR反應(yīng)質(zhì)量指標(biāo)PCR反應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有：特異性（序列選擇）有效性（序列產(chǎn)量）準(zhǔn)確性（序列對(duì)錯(cuò)）上述三大標(biāo)準(zhǔn)并非由單一原因所決定，所以在PCR反應(yīng)中必須對(duì)各種參數(shù)進(jìn)行聯(lián)合控制和改進(jìn)，但因?yàn)镻CR反應(yīng)中各參數(shù)往往是相互影響，所以任何參數(shù)改進(jìn)不可能同時(shí)滿足特異性、有效性、準(zhǔn)確性。基因工程lpcr技術(shù)第15頁基因工程lpcr技術(shù)第16頁1234Template+-++Primer1++-+Primer2+++-VerificationofPCRproducts

基因工程lpcr技術(shù)第17頁六、PCR污染控制設(shè)陰陽對(duì)照操作分區(qū)材料分裝防汽溶膠加樣次序使用專門儀器重復(fù)基因工程lpcr技術(shù)第18頁七、PCR技術(shù)應(yīng)用1、點(diǎn)突變技術(shù)2、錨定PCR（anchoredPCRA-PCR）3、不對(duì)稱PCR（asymmetryPCR）引物百分比1：1004、表示子PCR(expression-cassettePCRECPCR）酶切位點(diǎn)克隆噬菌體開啟子單鏈探針蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)物純化、檢測(cè)基因工程lpcr技術(shù)第19頁P(yáng)CR技術(shù)-點(diǎn)突變基因工程lpcr技術(shù)第20頁A-PCR基因工程lpcr技術(shù)第21頁5、反向PCR(inversePCR）6、原位PCR7、RAPD(RandomAmplificationPolymorphicDNAs)原理-引物-條件-應(yīng)用8、其它七、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析凝膠電泳雜交微孔板夾心雜交法（特異性高）:經(jīng)過一固定于微孔板捕捉探針與PCR產(chǎn)物某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再利用一生物素等非放射性標(biāo)識(shí)物標(biāo)識(shí)檢測(cè)探針與產(chǎn)物另一區(qū)域特異性進(jìn)行一次雜交，顯色后即可判斷結(jié)果.基因工程lpcr技術(shù)第22頁反向PCR基因工程lpcr技術(shù)第23頁基因工程lpcr技術(shù)第24頁基因工程lpcr技術(shù)第25頁Figure10.16.Vectorette(bubblelinker)PCRpermitsamplificationofuncharacterizedsequencesflankingaknownDNAsequence.Notethatthevectorettescontaincomplementarysequencesattheirendsbutunrelatedsequenceswithinthebubble.ArestrictionfragmentcontainingaknownsequenceAflankedbyuncharacterizedregionsXandYisligatedtoavectorettelinkercontainingasuitableoverhangatoneend.PCRamplificationoftheuncharacterizedsequenceXisthenpossibleusingaprimerspecificfortheknownDNAsequence(A)andaprimerspecificforoneofthestrandsofthebubbleinthevectorettelinker(B).ThevectorettelinkerprimerBcannotprimeDNAsynthesisinitiallyasthereisnosequencetowhichitcanbind:itisidentical,notcomplementaryinsequencetoonestrandofthebubble,andunrelatedinsequencetotheother.However,primerAinitiatessynthesisofacomplementaryDNAstrandwhichwillcontainasequencecomplementarytooneoftheuniquesequenceswithinthebubblelinker.Asaresult,primerBcanbindtothisnewlysynthesizedstrandandinitiatenewstrandsynthesistostartaPCRreaction.TheflankingsequenceYcansimilarlybeisolatedinanotherreactionusingasuitableA-specificprimerandabubble-specificprimerderivedfromthestrandoppositetothatusedformakingprimerB.基因工程lpcr技術(shù)第26頁3

Figure10.19.Alu-PCRpermitsamplificationofDNAsequenceslocatedbetweentwocloselypositionedbutoppositelyorientatedAlurepeats.(A)PrimerscanbedesignedfromtheAluconsensussequencetohybridizetosequencesateitherterminusoftherepeatelement,withthe5directionpointingawayfromtherepeatelement.(B)AsinglesuchprimercanbeusedinaPCRreactiontoamplifysequenceslocatedbetweentwoAlurepeatswhichareinoppositeorientation,andarrangedsuchthatthetwoboundprimersareconvergent(e.g.PCRwithprimer2alonecanamplifysequenceXbutnotYorZ;primer1alonecanamplifysequenceYbutnotXorZ).Acombinationofprimers1and2should,intheory,permitamplificationofsequencesbetweenrepeatsinthesameorientation.Inpractice,PCRamplificationmaybedifficultorimpossibleifthedistancebetweentherepeatsistoogreat基因工程lpcr技術(shù)第27頁P(yáng)CR-ELISA(EnzymeLinkageImmunosorbentassay)SchematicofPCRELISAprocedure.

Step1:LabelingofPCRproductwithdigoxigeninduringanamplificationreactioninthepresenceofdigoxigenin-11-dUTP(DIG-dUTP).

Step2:DenaturationofPCRproductandhybridizationtoabiotin-labeledcaptureprobe.ThecaptureprobespecificallyrecognizesaninternalsequenceofthetargetDNA.

Step3:Immobilizationofbiotin-labeledhybridonastreptavidin-coatedmicroplate,followedbywashesthatremoveunhybridized,non-specificamplificationproducts.

Step4:Detectionofboundhybridswithperoxidase-conjugatedanti-digoxigeninantibody(Anti-DIG-POD)andthecolorimetricperoxidasesubstrateABTS.基因工程lpcr技術(shù)第28頁顏色互補(bǔ)分析:顏色互補(bǔ)分析法是利用三原色原理，當(dāng)不一樣DNA片段（A和B）同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，用引物5’端修飾技術(shù)將不一樣引物用不一樣顏色熒光素標(biāo)識(shí)（A片段引物標(biāo)識(shí)綠色熒光素，B標(biāo)識(shí)紅色羅丹明）。假如僅有一條片段被擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物激發(fā)后，只有一個(gè)顏色（紅色或綠色）。假如兩條不一樣大小片段均被擴(kuò)增，可經(jīng)過電泳分離，紫外激發(fā)后可觀察到不一樣顏色兩條帶。假如兩條被擴(kuò)增片段大小相同，電泳后可見一條紅綠互補(bǔ)色-黃色帶。假如不用電泳法分離擴(kuò)增片段，經(jīng)過一定伎倆除未摻入引物，亦可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物顏色。此時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物不論大小，只要均被