克氏原螯蝦寄生蟲病的病原分離鑒定及耐藥分析

克氏原始繁殖蝦（procalcalni）通常被稱為小龍蝦，主要分布在江蘇省、浙江省、湖北省、湖南省、安徽省、上海市和山東省的10多個(gè)?。ㄊ校┖偷貐^(qū)。隨著我國(guó)克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖熱潮興起,相關(guān)疾病的報(bào)道也陸續(xù)出現(xiàn),這些疾病主要由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)2012年5月下旬,安徽省滁州市全椒縣2個(gè)稻田養(yǎng)殖場(chǎng)的克氏原螯蝦出現(xiàn)爆發(fā)性疾病,癥狀為病蝦不攝食,螯足無(wú)力,行動(dòng)遲緩,應(yīng)激能力較弱;部分個(gè)體體表皮膚變黑,甲殼內(nèi)壁無(wú)白斑及其他明顯癥狀,解剖可見肝胰臟顏色淡黃,腸道內(nèi)沒(méi)有食物。本課題組從2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的瀕死蝦肝胰腺分離到細(xì)菌,感染克氏原螯蝦確定其致病性,結(jié)合理化特性和16SrRNA、gyrB基因序列,16SrRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析,鑒定病原,并測(cè)定了該菌對(duì)20種抗生素的敏感性,期望為克氏原螯蝦細(xì)菌性疾病的防治提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1病原菌分離方法患病克氏原螯蝦取自安徽省滁州市全椒縣2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng),每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)取20尾鮮活病蝦,平均體重20g,用保溫箱冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室,選存活的8尾進(jìn)行病原分離。供試健康克氏原螯蝦購(gòu)自某公司位于池州市東至縣大渡口鎮(zhèn)新河口廣豐圩長(zhǎng)江段的養(yǎng)殖場(chǎng),蝦體長(zhǎng)11.3~12.5cm,體重20.8~30.7g。1.2細(xì)菌試劑和引物胰胨大豆瓊脂(TSA)、胰酶大豆肉湯(TSB)、腦心浸液肉湯(BHI)、MH瓊脂(MHA)、瓊脂、LB肉湯(LB)為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。革蘭氏染色液、芽孢染色液、微量生化管、20種抗生素紙片和檸檬酸桿菌CMCC48017購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。莢膜染色液為自配。Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(批號(hào):SK8255)購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司,PCR引物也由該公司合成。PCR相關(guān)試劑、TakaraMINIBESTagarosegelDNAextractionkit(D823A)、pMD18-T購(gòu)于Takara公司。1.3菌株組合分離取鮮活的患病克氏原螯蝦8只,無(wú)菌取肝胰腺,剪碎,粘取一些組織液接種于TSA、含5%綿羊血TSA和BHI瓊脂平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)24h后,隨機(jī)挑取8個(gè)菌落重復(fù)劃線分離,直至得到純培養(yǎng)。將純化的菌株分別用TSB培養(yǎng)基28℃過(guò)夜搖勻培養(yǎng),加終濃度20%甘油,-20℃冰箱保存用于進(jìn)一步鑒定。1.4人工感染試驗(yàn)1.4.1克氏原螯蝦幼蝦注射前后養(yǎng)殖將鮮活患病的克氏原螯蝦的鰓組織無(wú)菌剪碎,勻漿,加10倍生理鹽水,10000r/min離心,0.22μm濾膜過(guò)濾,肌肉注射健康克氏原螯蝦20尾,注射后養(yǎng)殖觀察30d。1.4.2微生物指標(biāo)檢測(cè)將代表株X120523在28℃培養(yǎng)18~24h后,用0.65%無(wú)菌生理鹽水洗下,制成菌懸液,結(jié)合顯微計(jì)數(shù)和光電比濁計(jì)數(shù)法(波長(zhǎng)625nm)測(cè)定菌液中細(xì)菌濃度,并將菌液最終濃度調(diào)至5×101.5微量生化管里進(jìn)行致病菌的形態(tài)及生理生化特性試驗(yàn)按照文獻(xiàn)[7]和文獻(xiàn)[8]所述方法,在微量生化管里進(jìn)行。并用檸檬酸桿菌(CMCC48017)作參考菌株,進(jìn)行同步試驗(yàn)。1.6基因組dna提取取分離株接種于TSB中28℃過(guò)夜培養(yǎng),用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA作為PCR模板。16SrRNA基因PCR擴(kuò)增的通用引物分別為fD1/rD11.7序列同源性分析將代表株X120523的16SrRNA和gyrB基因序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列同源性分析,使用ClustalX2軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)的11個(gè)種模式株1.8藥物過(guò)敏試驗(yàn)試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法2結(jié)果2.1菌株篩選及pcr擴(kuò)增8尾克氏原螯蝦肝胰腺組織液在TSA和BHI瓊脂上均長(zhǎng)出大量色澤和形態(tài)均一的菌落,菌落表面整齊,顏色透明,中間隆起,乳白色,大小為1~2mm。在5%綿羊血TSA平板上形成典型的γ溶血。從8尾病蝦分離的細(xì)菌中各隨機(jī)挑選1個(gè)菌株進(jìn)行PCR16SrRNA擴(kuò)增、測(cè)序,獲得的8條序列基本一致,挑選一株為代表并編碼為X120523進(jìn)一步鑒定。組織勻漿過(guò)濾液注射感染克氏原螯蝦,沒(méi)有蝦發(fā)生死亡或病變。將代表株X120523系列稀釋,肌肉注射健康克氏原螯蝦,病原對(duì)克氏原螯蝦的半致死濃度約為3.16×102.2理化特性鑒定結(jié)果代表株X120523的革蘭氏染色、芽孢染色和莢膜染色結(jié)果顯示細(xì)菌為革蘭氏陰性菌,兩端鈍圓,短桿狀,無(wú)芽孢,無(wú)莢膜。分離株的38個(gè)理化特性鑒定結(jié)果見表2。其中除棉籽糖、七葉苷的鑒定結(jié)果與參考株檸檬酸桿菌CMCC48017的鑒定結(jié)果不同外,其他結(jié)果均與參考株的相應(yīng)結(jié)果一致,表明X120523屬于檸檬酸桿菌屬。該菌的各項(xiàng)理化指標(biāo)結(jié)果符合弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)相應(yīng)指標(biāo)的特征2.3srrna基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析代表株X12052316SrRNA和gyrB基因序列長(zhǎng)度分別為1464bp和1171bp,在GenBank中登錄號(hào)分別為KF156749和KF156750。將X120523的16SrRNA基因序列進(jìn)行同源性檢索,顯示的100條序列同源性均為99%以上,基本為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌。X120523與檸檬酸桿菌屬細(xì)菌16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析顯示,X120523與弗氏檸檬酸桿菌(登錄號(hào)為JN585667)聚為一分支,置信度為87%,它們與4種細(xì)菌模式株(弗氏檸檬酸桿菌AJ233408、魏氏檸檬酸桿菌AF025373、莫林檸檬酸桿菌NR_028688和布氏檸檬酸桿菌AF025368)的同源性均很高,系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。X120523gyrB基因同源性搜索結(jié)果顯示與弗氏檸檬酸桿菌的同源性最高,達(dá)95%以上。2.4種氨基糖苷類抗生素和頭孢他啶代表株X120523對(duì)7種喹諾酮類抗生素、5種氨基糖苷類抗生素和頭孢他啶敏感,對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明中度敏感,對(duì)5種抗生素(克林霉素、頭孢氨芐、麥迪霉素、新生霉素和強(qiáng)力霉素)耐藥。3克氏原螯蝦的rb基因分析代表菌X120523的回歸感染試驗(yàn)表明其能導(dǎo)致克氏原螯蝦死亡。結(jié)合理化特征、16SrRNA基因和gyrB基因分析,代表菌X1