超聲波輔助提取克氏原螯蝦青素的研究

克氏原始錨大鼠、節(jié)肢動物門、甲殼綱、足量科。原產(chǎn)于墨西哥北部和美國南部,1929年由日本引入南京克氏原螯蝦味道鮮美深受人民喜愛,如江蘇省年消費(fèi)克氏原螯蝦約20萬t,年產(chǎn)值200億元蝦青素又名蝦黃素、蝦黃質(zhì),因其分子中含有很長的共軛雙鍵鏈和不飽和α-羥基酮而具有極強(qiáng)的抗氧化性能,能有效清除體內(nèi)自由基、硫化物、二硫化物,具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、保護(hù)視網(wǎng)膜等功效,可應(yīng)用于保健食品、高檔化妝品、藥品等領(lǐng)域中。有資料顯示,新鮮克氏原螯蝦殼濕料中蝦青素含量在80～90μg/g目前蝦青素常采用的提取工藝有堿提法、油溶法、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界CO本研究以克氏原螯蝦殼為原料,以蝦青素提取量為指標(biāo),采用超聲波輔助法提取蝦青素,探討提取劑種類、超聲波作用時間、超聲波功率和料液比等因素對蝦青素提取量的影響,并通過響應(yīng)面分析優(yōu)選出最佳提取方案。1材料和機(jī)器1.1實(shí)驗(yàn)材料克氏原螯蝦,盱眙龍盛龍蝦養(yǎng)殖場提供;蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2儀器、檢測設(shè)備WF180萬能粉碎機(jī),上海光學(xué)儀器廠;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;SHA-C恒溫水浴振蕩器,上海醫(yī)療器械廠;TDL40C低速大容量離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1900紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;JA1003A電子精密天平,上海倫捷機(jī)電儀表有限公司;JY92-DN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1蝦殼的剝除新鮮螯蝦沸水煮制2min后自然冷卻,剝除蝦仁和內(nèi)臟,流水洗凈蝦頭、尾及殼,避光、密封于-20℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前用萬能粉碎機(jī)粉碎,過篩后使用。2.2超聲細(xì)胞粉碎機(jī)準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量蝦殼粉,按比例加入一定體積提取劑浸泡2h,超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲處理,離心后取上清液,重復(fù)3次,混合上清液,于60℃旋轉(zhuǎn)蒸干后用丙酮溶解并定容至10mL2.3提取蝦青素的測定2.3.1最大吸收波長的確定吸取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液和螯蝦殼提取液各1.0mL于比色管中,丙酮定容至25mL,混合均勻后以丙酮做基線,用紫外-可見分光光度計在300～700nm波長內(nèi)進(jìn)行掃描,得到蝦青素和蝦殼提取液的吸收光譜,通過對比確定最大吸收波長。2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL1.0mg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中,用丙酮定容至25mL,混合均勻后在最大吸收波長處測定吸光度,以吸光度值為縱坐標(biāo),蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。結(jié)果表明蝦青素在10～50μg/mL內(nèi)線性回歸方程為y=0.0086x-0.0063,相關(guān)系數(shù)為0.9995。2.3.3樣品測定吸取1.0mL螯蝦殼提取液置于比色管中,按照2.3.2測定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蝦殼提取液中蝦青素含量。3結(jié)果與分析3.1最大吸收波長的確定由圖2可知,在300～700nm內(nèi),蝦青素和提取液的吸光度隨著波長的增加先增加后降低,且均在478nm處吸收最強(qiáng),這說明提取液中的主要成分為蝦青素,因此可以選擇蝦青素為標(biāo)準(zhǔn)品,以478nm作為最大吸收波長。3.2克氏原螯蝦殼中蝦青素提取準(zhǔn)確稱取6份5.0g的蝦殼粉樣品,分別加入100mL石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮,在超聲波功率120W條件下處理30min,根據(jù)2.2、2.3步驟進(jìn)行蝦青素提取和含量測定,結(jié)果見圖3。由圖3可知,不同提取劑對蝦殼中蝦青素提取的效果有明顯差異。其中二氯甲烷和丙酮的提取效果最好,提取量均在50μg/g以上。而石油醚和正己烷的提取量均小于40μg/g。6種提取劑對蝦青素提取量影響的大小順序?yàn)?二氯甲烷>丙酮>三氯甲烷>乙酸乙酯>正己烷>石油醚。這主要是因?yàn)槲r青素結(jié)構(gòu)中含有大量疏水基團(tuán)和2個親水的羥基,整體極性很低,屬于非極性物質(zhì),根據(jù)相似相溶原理可知該物質(zhì)易溶于極性較低的有機(jī)溶劑。而6種試劑極性順序依次為:丙酮<三氯甲烷<乙酸乙酯<二氯甲烷<正己烷<石油醚,因此丙酮的提取率較高。而二氯甲烷的提取率較高可能是因?yàn)槎燃淄槟苋苡诩s50份水中,有利于蝦青素的提取。但水溶二氯甲烷不易回收,因此選擇丙酮作為提取溶劑。3.3蝦青素提取和測定準(zhǔn)確稱取7份5.0g的蝦殼粉樣品,加入100mL丙酮,在超聲波功率120W條件下分別處理5、10、15、20、25、30、35min,根據(jù)2.2、2.3步驟進(jìn)行蝦青素提取和含量測定,結(jié)果見圖4。由圖4可知,蝦青素含量隨超聲作用時間的延長先快速增加,這主要是因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的機(jī)械粉碎和空化效應(yīng)使蝦青素和溶劑分子運(yùn)動速度增大,提高了蝦青素的溶出速度和溶出數(shù)量,增加了溶劑的穿透能力3.4蝦青素的提取準(zhǔn)確稱取7份5.0g的蝦殼粉樣品,加入100mL丙酮,分別在超聲波功率100、120、140、160、180、200、220W處理25min后,根據(jù)2.2、2.3步驟進(jìn)行蝦青素提取和含量測定,結(jié)果見圖5。由圖5可知,隨著超聲波功率的增加,蝦青素提取量先快速增加,但是超過一定功率(160W)后,提取量增加變化不明顯。這主要是因?yàn)槌暡üβ试酱?空化作用和機(jī)械作用越劇烈,蝦青素和丙酮分子的運(yùn)動速度越大,蝦青素分子擴(kuò)散滲出速度也就越快3.5料液比對蝦青素提取效果的影響準(zhǔn)確稱取7份5.0g的蝦殼粉樣品,分別加入50、60、70、80、90、100、110mL丙酮,在超聲波功率160W條件下處理25min后,根據(jù)2.2、2.3步驟進(jìn)行蝦青素提取和含量測定,測定結(jié)果見圖6。由圖6可知,當(dāng)料液比為1:10時,提取出的蝦青素含量很低(僅為8.621μg/g),這主要是因?yàn)樵趩挝粫r間內(nèi)(25min)每個丙酮與蝦青素分子接觸的次數(shù)是固定的,萃取出的蝦青素分子數(shù)量也是固定的。丙酮數(shù)量越少,萃取出的蝦青素數(shù)量也就越少。另外,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)料液比為1:10時,蝦殼中的蛋白質(zhì)乳化,溶液黏度增加,蝦青素和蝦殼廢料分離困難。隨著丙酮添加量的不斷增加,蝦青素在蝦殼與溶劑中的濃度差加大,提取量增大,當(dāng)?shù)竭_(dá)1:18時出現(xiàn)峰值(58.34μg/mg)。當(dāng)料液比大于1:18時蝦青素含量開始降低,這可能是因?yàn)檎舭l(fā)回收丙酮時的60℃高溫(丙酮沸點(diǎn)為56℃)導(dǎo)致了部分蝦青素發(fā)生分解反應(yīng)。因此從蝦青素提取效果和能耗等多方面考慮應(yīng)選定料液比為1:18。3.6蝦青素提取條件的優(yōu)化3.6.1中心組合設(shè)計原理在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,依據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理,以超聲作用時間、超聲波功率、料液比為因素,蝦青素含量為響應(yīng)值,設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。因素水平編碼表見表1,實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。3.6.2提取量與回歸方程結(jié)果及分析采用sas軟件對Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行回歸分析,并建立二次響應(yīng)面回歸方程。從模型方差分析結(jié)果(表3)可知,回歸方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、總和的F值均為極顯著(P值<0.01),失擬項(xiàng)的F值顯著(P<0.05),方程總決定系數(shù)R由表4可知,擬合的二次多項(xiàng)回歸方程為:提取量=-419.96+6.55925X根據(jù)表4中一次項(xiàng)參數(shù)估計可知,三因素對蝦青素含量影響的次序?yàn)榱弦罕?gt;時間>功率,且料液比、時間、功率對提取量均為正效應(yīng)。3.6.3反應(yīng)曲線分析3.6.3.超聲波功率對提取量的影響固定料液比為1:18,繪制超聲作用時間與超聲功率對提取量影響的響應(yīng)曲面圖,結(jié)果見圖7。由圖7可知,隨著超聲波作用時間的延長,提取量先增大后減小;隨著超聲波功率的增大,提取量先快速上升后緩慢降低;由相應(yīng)面可知,圖形上凸,這說明超聲時間與超聲波功率的協(xié)同作用明顯。3.6.3.超聲波作用時間對提取量的影響固定超聲波功率為160W,繪制超聲時間與料液比對提取量影響的響應(yīng)曲面圖,結(jié)果見圖8。由圖8可知,隨著超聲波作用時間的延長,提取量先增大后快速降低;隨著料液比的增大,提取量先增大后減小;由相應(yīng)面可知,圖形向上凸,說明超聲時間與料液比的協(xié)同作用明顯。3.6.3.超聲波用量對提取量的影響固定超聲時間25min,繪制超聲波功率與料液比對提取量影響的響應(yīng)曲面圖,結(jié)果見圖9。由圖9可知,隨著超聲波功率和料液比的增加,提取量先快速增大后略有下降;由相應(yīng)面可知,圖形向上凸,說明超聲波功率與料液比的協(xié)同作用明顯。3.6.4最佳提取條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)由sas軟件擬合二次回歸模型得出最優(yōu)條件和最優(yōu)值,見表5。由表5可知,當(dāng)提取量最大時,X為驗(yàn)證方程與實(shí)際情況的吻合程度,進(jìn)行最佳提取條件(超聲作用時間29.4min、超聲波功率163W、料液比為1:18.2)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為62.52μg/g,與模擬結(jié)果基本符合。因此確定最佳提取條