用于生物化學(xué)大分子研究的獨特的分析、制備技術(shù)生物化學(xué)實驗技術(shù)的主要特點是：①操作溫和，使對所研究組分的天然結(jié)構(gòu)和功能的損害，盡可能減少至最小。②微量分析，低達ng或pg水平；或大量分離制備，高達公斤級。③分辨率高，可明確區(qū)分結(jié)構(gòu)或性質(zhì)極其相似的物質(zhì)。

現(xiàn)代生物化學(xué)實驗技術(shù)，按其目的和性質(zhì)分為三大類。

一、按不同的物理化學(xué)性質(zhì)進行分析鑒定和分離制備，其中又可分為五類

①根據(jù)分子的大小進行分辨者，有凝膠過濾法、超速離心法、超濾法、SDS電泳分析等。②根據(jù)分子荷電情況進行分辨者，有等電聚焦電泳法、離子交換層析法等。③根據(jù)吸收光譜和放射性等性質(zhì)進行分辨者,有紫外/紅外/熒光分光光度法、X射線結(jié)構(gòu)分析法、電子順磁共振,電子自旋共振和核磁共振法,以及放射性核素示蹤和放射免疫分析法等。④根據(jù)疏水相互作用或氫鍵形成的引力進行分辨者，有反相高效液相層析、分子雜交技術(shù)等。⑤根據(jù)特異相互作用進行分辨者，有親和層析、免疫化學(xué)分析法等。

二、經(jīng)一系列不同的化學(xué)和物理方法處理，以求得差異分辨，或按指令合成不同的高分子物質(zhì)。如氨基酸序列分析和序列合成、核苷酸序列分析和序列合成等。三、有目的地對DNA進行剪切拼接，引入細胞中的（或分子克隆技術(shù)）等。

細胞破碎定義

從含有多種組分的混合物中將某種生化物質(zhì)與其他物質(zhì)分離的技術(shù)目的縮短整個下游過程的流程和提高單項操作的效率

新趨勢——高效集成化

1繼續(xù)研究和完善一些適用于生化工程的新型分離技術(shù)；2進行各種分離技術(shù)的高效集成化。第一篇生化分離技術(shù)定義采用一定的方法，在一定程度上破壞細胞壁和細胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中，破碎后的細胞漿液經(jīng)固液分離除去細胞碎片后，再采用不同的分離手段進一步純化.第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細胞破碎細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物細胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)細菌：肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)真菌：細胞壁更厚植物細胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)初生壁，次生壁具有很高的機械強度細胞破碎技術(shù)一機械破碎法

通過機械運動產(chǎn)生的剪切力作用使細胞破碎的方法。分為搗碎法、研磨法和勻漿法1.1搗碎法利用搗碎機的高速旋轉(zhuǎn)葉片產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎。如葉綠體的分離常用于動物內(nèi)臟、植物葉片等較脆嫩的組織細胞；微生物細胞破碎也可以使用1.2勻漿法影響勻漿破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)。高壓勻漿法的適用范圍較廣，在微生物細胞和植物細胞的大規(guī)模處理中常采用.高速珠磨機研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中常采用高速珠磨機1.3研磨法2.1反復(fù)凍溶法原理：反復(fù)凍融過程中，由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為黏稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。方法：將待破碎的細胞于冷藏庫或干冰反復(fù)于零下15-20℃使之凝固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部分細胞及細胞內(nèi)顆粒破壞。

特點：此法適用于組織細胞，多用于動物性材料，對微生物細胞作用較差。

二物理破碎法物理法破碎細胞主要通過各種物理因素使組織細胞破碎。將材料投入沸水中，維持90℃左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰水浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。2.2冷熱更替法2.3壓力差破碎法通過壓力的突然變化，使細胞破碎。高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。

破碎機理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及首種類型等因素有關(guān)。

2.4超聲波處理

存在問題：超聲波破碎在實驗室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。

而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用?？栈饔檬羌毎茐牡闹苯釉颍瑫r會產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護劑。特點：操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間；多用于微生物和組織細胞的破碎。三化學(xué)破碎法某些有機溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。

作用機理：化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。

特點：多用于破碎細菌，且作用比較溫和；提取核酸時，常用此法破碎細胞。

存在的問題：時間長，效率低；化學(xué)試劑毒性較強，同時對產(chǎn)物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。四酶促破碎法利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細胞壁分解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8mol/L尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。存在的問題：易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高，限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶，則又增加分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取，給進一步純化帶來困難。特點：

a、此法適用多種微生物；

b、具有作用條件溫和；

c、內(nèi)含物成分不易受到破壞；

d、細胞壁損壞的程度可以控制

五選擇破碎方法的依據(jù)(1)細胞的處理量(2)細胞壁的強度和結(jié)構(gòu)(3)目標產(chǎn)物對破碎條件的敏感性(4)破碎程度適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率，低的能耗和便于后步提取這二方面進行權(quán)衡六破碎技術(shù)研究的方向(1)多種破碎法的結(jié)合(2)與上游技術(shù)結(jié)合(3)與下游操作技術(shù)結(jié)合第二節(jié)提取定義：一定條件下，用適當?shù)娜軇ㄈ芤海┨幚碓鲜褂蛛x物質(zhì)充分溶解到溶劑（溶液）中的過程。也稱為抽提。一提取方法1.1鹽溶液提取鹽溶/鹽析：低鹽下，蛋白質(zhì)溶解度隨鹽濃度的升高而增加/鹽濃度達到某一界限后，蛋白質(zhì)溶解度隨鹽濃度升高而下降。低鹽—蛋白質(zhì)提取—0.02-0.5mol/L高鹽—蛋白質(zhì)沉淀1.2酸溶液提取酸性條件下，溶解度大、穩(wěn)定的物質(zhì)使用PH不能太低，以免失活；一般PH3-61.3堿溶液提取堿性條件下，溶解度大、穩(wěn)定的物質(zhì)使用PH不能過高，以免影響酶活性；1.4有機溶劑提取與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的蛋白質(zhì)，采取與水可以混溶的乙醇、丙酮等有機溶劑提取；

DNA和RNA可以采用苯酚水溶液提取：

DNA、蛋白質(zhì)-苯酚層

RNA、多糖-水層二影響因素

2.1溶解度相似者相溶，物質(zhì)極性、溫度、PH2.2擴散速度溫度、溶液黏度、擴散面積、擴散距離、兩相濃度差2.3提取液體積提取液總量一般為原料體積的3-5倍第三節(jié)沉淀分離定義：經(jīng)沉淀反應(yīng)使不同組分相互分離的方法一般做法是控制適當?shù)膒H值，加入沉淀劑使少數(shù)幾種組分首先沉淀，過濾分離后重新調(diào)節(jié)pH值，加入另種沉淀劑使另外少數(shù)幾種組分生成沉淀。如此依次沉淀和分離后，可將復(fù)雜試樣中的各組分分成若干組，使得復(fù)雜的分析問題變得較簡單。鹽析/有機溶劑沉析/等電點沉析/有機聚合物沉析/其他沉析技術(shù)一鹽析原理溶液加入高濃度中性鹽后，鹽離子與生物分子表面的帶相反電荷的離子基團結(jié)合，中和了生物分子表面的電荷，降低了生物分子與水分子之間的相互作用，生物分子表面水化膜逐漸被破壞，當鹽濃度達到一定的限度時，生物分子之間的排斥力降到很小，此時生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，從而形成沉淀從溶液中析出。產(chǎn)生鹽析的另一個原因是大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使生物分子脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀析出。

影響鹽析的因素（一）鹽離子濃度在低鹽濃度時，鹽離子能增加生物分子表面電荷，使生物分子水合作用增強，具有促進溶解的作用，稱鹽溶現(xiàn)象。當鹽濃度達一定值后,鹽濃度升高，生物分子溶解度不斷降低,產(chǎn)生了鹽析作用,不同的生物分子，“鹽溶”與“鹽析”的分界值不同。

（二）生物分子種類生物分子的分子結(jié)構(gòu)不同，其分子表面親水基團與疏水基團不相同，不同生物分子產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象所需中性鹽的濃度（離子強度）亦不同。（三）生物分子濃度溶液中生物分子的濃度對鹽析的效果有很大的影響，要得到理想的沉析效果，必須將生物分子的濃度控制在一定的范圍內(nèi)。一般對于蛋白質(zhì)溶液，其濃度為2%～3%比較合適。（四）pH值在鹽析時，如果要沉析某一成分，應(yīng)將溶液的pH值調(diào)整到該成分的等電點，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，則應(yīng)使溶液的pH值偏離該成分的等電點。（五）溫度多數(shù)物質(zhì)的溶解度會受溫度變化的影響。

鹽析的操作與應(yīng)用（一）鹽析的操作1、鹽的處理硫酸銨使用時要求純度較高，生產(chǎn)時為降低成本，一般選用化學(xué)純的硫酸銨，在使用前應(yīng)進行預(yù)處理，可通過化學(xué)法將重金屬除去（如通入H2S后過濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。2、加鹽的方法（1）直接加入固體硫酸銨法（2）加入飽和硫酸銨溶液法3、鹽析操作注意事項（1）鹽析反應(yīng)完全需要一定時間，一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可進行固-液分離。（2）經(jīng)過一次分級得到的鹽析沉淀，能否進行第二次鹽析要靠試驗確定。（3）鹽析操作時加入鹽的純度、加量、加入方法、攪拌的速度、溫度及pH等參數(shù)應(yīng)嚴格控制。

（4）鹽析時生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收率、鹽量和固-液分離等問題。一般低濃度硫酸銨可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因為高濃度硫酸銨密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要較高的離心速率和較長的離心時間。

（5）鹽析后溶液應(yīng)進行脫鹽，常用的辦法有透析、凝膠過濾及超濾等。

（二）鹽析的主要應(yīng)用

鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能達到很好的分離效果。由于成本低，操作安全簡單，對許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸等物質(zhì)的分離純化。

二等電點沉析等電點沉析原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達到某一生化物質(zhì)的等電點，使其從溶液中沉淀析出而實現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點沉析技術(shù)。等電點(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點的凈電荷為零時介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時溶質(zhì)的溶解度最低

等電點沉析的注意事項（一）等電點的改變（二）目的物的穩(wěn)定性（三）鹽溶作用（四）pH的調(diào)節(jié)

等電點沉析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點的特性來進行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點沉析只適用于水化程度不大，在等電點時溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(pH=5.4)附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。

三有機溶劑沉析原理（一）親水性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，使溶質(zhì)分子周圍的水化層變薄，導(dǎo)致脫水而相互聚集析出，也就是降低了溶質(zhì)的溶解度。（二）有機溶劑的介電常數(shù)比水小，加入有機溶劑后，整個溶液的介電常數(shù)降低，帶電的溶質(zhì)分子之間庫侖引力增強，使溶質(zhì)分子相互吸引而聚集。

影響有機溶劑沉析的因素（一）溫度大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過濃。溫度越低，得到的生物活性物質(zhì)越多，而且可以減少有機溶劑的揮發(fā)。（二）生物樣品的濃度

與鹽析相似，樣品濃度低時增加有機溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果。反之，對于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機溶劑，減少了變性的危險，但共沉作用大，分離效果下降。一般認為，對于蛋白質(zhì)溶液0.5%-2%起始濃度較合適,對于粘多糖以1%-2%為起始濃度為宜。（三）pH有機溶劑沉析時適宜的pH，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點附近，以提高該沉析的分辨能力。但應(yīng)注意的是有少數(shù)生物分子在等電點附近不穩(wěn)定，影響其活性；同時盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生。（四）離子強度在有機溶劑和水的混合液中，當離子強度很小，物質(zhì)不能沉析時，補加少量電解質(zhì)即可解決。鹽的濃度太大(0.1-0.2mol／L以上)，就需大量的有機溶劑來沉析，并可能使部分鹽在加入有機溶劑后析出。同時鹽的離子強度達一定程度時，還會增加蛋白質(zhì)或酶在有機溶劑中的溶解度。所以一般離子強度在0.05或稍低為好，既能使沉析迅速形成，又能對蛋白質(zhì)或酶起一定的保護作用，防止變性。（五）金屬離子在用有機溶劑沉析生物高分子時還應(yīng)注意到某些金屬離子的助沉作用，一些金屬離子如Zn2+、Ca2+等可與某些呈陰離子狀態(tài)的生物高分子形成復(fù)合物。這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機溶劑的耗量，0.005-0.02mol／L的Zn2+可使有機溶劑用量減少l／3至1／2,使用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。

有機溶劑沉析的應(yīng)用（一）有機溶劑沉析的特點優(yōu)點：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過濾比較容易。缺點：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。

（二）應(yīng)用

有機溶劑沉析技術(shù)經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分離。使用時先要選擇合適的有機劑，然后注意調(diào)控樣品的濃度、溫度、pH和離子強度，使之達到最佳的分離效果。沉析所得的