藍藻小質(zhì)粒的分離及表達載體的構建

藻類是能夠在大約150個屬中進行植物研究的原核生物，具有很強的適應性，分布在世界各地。由于綠藻在細胞結構、代謝、遺傳和進化方面具有獨特的性質(zhì)，因此多年來被廣泛用于研究光合作用、固氮作用、葉綠體起源和植物生長發(fā)育等重要的生物學問題。特別是近年來，隨著墓碑善化劑的出現(xiàn)和對綠藻酶的深入研究，藍藻被認為是一個獨特的互補互補激活系統(tǒng)。藍藻作為基因工程受體系統(tǒng),兼具微生物和植物的優(yōu)點.藍藻基因組為原核型,遺傳背景簡單,便于基因分析和外源DNA檢測;細胞壁為G-,主要由肽聚糖組成,便于外源DNA轉化;多種藍藻含內(nèi)源質(zhì)粒,為利用和改造這些質(zhì)粒構建適用于藍藻的穿梭質(zhì)粒載體提供了很好的條件.藍藻營光合自養(yǎng)生長,培養(yǎng)條件簡單,成本低廉,只需光、CO2、無機鹽和合適的溫度就能生長,適于大規(guī)模生產(chǎn).并且多數(shù)藍藻富含蛋白質(zhì),無毒,是一類營養(yǎng)豐富的天然食品,若在此基礎上轉入有用的外源基因,可獲得能生產(chǎn)不同用途物質(zhì)的轉基因藍藻,達到錦上添花的效果.為了使外源目的基因能有效地轉入藍藻細胞,并能有效表達,構建適用于藍藻的基因表達載體就成為關鍵.為此,我們以藍藻內(nèi)源質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒構建了系列穿梭質(zhì)粒表達載體;根據(jù)DNA同源重組的性質(zhì)發(fā)展了藍藻基因整合平臺系統(tǒng),構建了多種含外源基因表達調(diào)控元件的供體質(zhì)粒表達載體.利用構建的基因克隆載體已有一些外源目的基因轉入藍藻細胞,并得以表達.TandeaudeMarsac以pUC303為載體,在單胞藍藻Synechococcussp.PCC7942中表達了原核基因芽孢桿菌殺幼蚊毒素基因,進一步研究證實轉基因藍藻具有一定的殺幼蚊毒性.而且有幾種真核基因也在藍藻細胞中得以表達.Fukuda等人以pUC303為載體,在單胞藍藻Synechococcussp.PCC7942中表達了植物的乙烯合成酶基因.孫軍等人將小鼠金屬硫蛋白-1(mMT-1)cDNA基因片段與穿梭質(zhì)粒表達載體pDC-8重組,在固氮絲狀藍藻Anabaenasp.PCC7120中表達了金屬硫蛋白;周杰等人利用基因整合平臺系統(tǒng)將人肝金屬硫蛋白(MT)突變體β基因整合到Synechocystissp.PCC6803的染色體上,并在藍藻中得以表達.閆艷春等人同樣將抗性尖音庫蚊酯酶B1基因與穿梭質(zhì)粒表達載體pDC-8重組,在藍藻Synechococcussp.PCC7942中表達了有活性的這種酯酶.Price等人通過穿梭表達載體pCA在藍藻Synechococcussp.PCC7942中表達了人的碳酸酐酶基因,對藍藻細胞的光合作用產(chǎn)生了一定影響.國內(nèi)外的一系列研究結果表明,通過構建合適的表達載體,以藍藻為受體系統(tǒng)不僅可以表達原核基因,而且還可以表達真核基因,甚至于人的基因.在大腸桿菌和酵母等基因工程受體系統(tǒng)以外另辟新徑,通過基因工程手段,以藍藻作為廉價的生物反應器來生產(chǎn)有用的產(chǎn)品,特別是來源缺乏、價值昂貴的生物藥物,這將有利于綜合利用藍藻,提高開發(fā)藍藻的經(jīng)濟效益,拓寬生物藥物的來源,具有重大的科學意義和應用前景.本課題組從1985年開始確定藍藻作為轉基因受體表達系統(tǒng),開展藍藻基因工程基礎研究和應用開發(fā)研究,先后得到3次國家自然科學基金和1次國家“863”項目經(jīng)費的資助,取得了多項研究成果.1序列及序列分析在檢測多種藍藻內(nèi)源質(zhì)粒的過程中,發(fā)現(xiàn)藍藻Plectonemaboryanum細胞內(nèi)含有大、小兩種質(zhì)粒.對小質(zhì)粒經(jīng)多種限制性內(nèi)切酶酶切分析,發(fā)現(xiàn)ClaI、HpaI和HpaII在小質(zhì)粒上各有一個識別序列,酶切后均產(chǎn)生1.5kb的DNA片段.把這種小質(zhì)粒定名為pPbS(或pPf1、pPb1).并以ClaI識別序列ATGCAT的第一位堿基A為+1,測定了pPbS的全部核苷酸序列,測定結果見圖1.從圖1看出,pPbS全長1511bp.該序列已被收入Genbank(AccessoinNo.AF176225).pPbS是目前檢測過的藍藻中屬于最小的內(nèi)源質(zhì)粒之一.如此小的質(zhì)粒既然能在藍藻細胞中穩(wěn)定維持,表明此質(zhì)粒具有復制的功能,含有控制復制的核苷酸序列,即復制起始區(qū)和復制起始位點.根據(jù)很多質(zhì)粒的復制起始區(qū)都具有多個重復序列區(qū),并且復制起始位點大多包含一個富AT的序列,其上游有一個GC含量比較高的發(fā)夾結構和一個共有的Rep蛋白質(zhì)靶序列TTGATA,在pPbS上找到了相應的核苷酸序列區(qū).初步確定pPbS的復制起始區(qū)在核苷酸序列568～1460之間,其中939～970的核苷酸序列很可能是復制起始位點,含有TTGATA序列、富含GC的發(fā)夾結構和富AT序列(見圖1).2穿透質(zhì)粒載體作為藍藻質(zhì)粒表達載體,必須能轉化藍藻細胞,在其中進行有效復制,并且還必須含有能調(diào)控外源基因表達的啟動子和終止子以及合適的克隆位點.現(xiàn)在已有大量用于轉化大腸桿菌的質(zhì)粒載體,但是這些載體不能直接用于轉化藍藻.藍藻內(nèi)源質(zhì)粒屬于隱蔽型質(zhì)粒,也不能直接作為載體用于轉化藍藻.只有構建成穿梭質(zhì)粒,不僅含有大腸桿菌源質(zhì)粒的復制起始位點,而且也含有藍藻源質(zhì)粒的復制起始位點,這樣的質(zhì)粒既能轉化大腸桿菌,又能轉化藍藻.pPbS是構建這種穿梭質(zhì)粒很好的材料.由于pPbS是一種很小的質(zhì)粒,即使整個質(zhì)粒作為穿梭質(zhì)粒的復制起始區(qū)和復制起始位點,也只有1511bp.我們選用pPbS上只有一個識別序列,并且不在復制起始區(qū)內(nèi)的限制性內(nèi)切酶ClaI,同時切割pPbS和大腸桿菌質(zhì)粒pBR322,連接重組后獲得了穿梭質(zhì)粒pPRS-1(5.8kb).進一步以pPRS-1為出發(fā)質(zhì)粒,經(jīng)多次亞克隆,組裝上含有CaMV35S啟動子、多克隆位點和rbcS終止子的表達盒以及Kmr基因,獲得了穿梭質(zhì)粒表達載體pPKE2(9.6kb)(見圖2).這是一種適用于藍藻的強表達載體.并且由于穿梭質(zhì)粒表達載體通過轉化進入受體細胞后未插入染色體DNA,不會影響受體細胞的自穩(wěn)系統(tǒng),所以轉基因藍藻除了表達外源目的基因產(chǎn)物以外,一般能維持原來的性狀,因此可以認為是比較安全的.其缺點是攜帶外源目的基因的這種質(zhì)粒載體進入受體細胞后容易丟失,導致目的基因表達的不穩(wěn)定性.但是可以通過選擇標記藥物經(jīng)常篩選轉基因藻株,維持其相對的穩(wěn)定性.3構建基因整合平臺建立基因整合平臺系統(tǒng)是克服穿梭質(zhì)粒表達載體在受體細胞內(nèi)不能穩(wěn)定維持的根本措施.根據(jù)DNA同源重組的原理,選擇受體細胞染色體DNA上一個合適的核苷酸序列區(qū)域作為外源基因整合的靶位,并在基因表達盒的一側或兩側組裝與整合靶位同源的一個或兩個合適DNA片段,構建相應的基因整合表達載體,成為一個基因整合平臺系統(tǒng).只要將含有外源基因的DNA片段插入基因表達盒的克隆位點,就有可能定位整合到受體細胞染色體DNA的整合靶位上,穩(wěn)定地隨染色體DNA的復制而復制,并在表達盒啟動子的控制下進行有效的表達.我們分別選擇藍藻Calothrixsp.PCC7601藻藍蛋白操縱子2(cpc2)和Synechococcussp.PCC7942鐵缺乏誘導基因isiAB操縱子作為整合靶位,建立了Calothrixsp.PCC7601和Synechococcussp.PCC7942基因整合平臺系統(tǒng).為了使建立的基因整合平臺系統(tǒng)能高效表達外源目的基因,表達盒中分別組裝了熱休克基因groESL啟動子和cpc2啟動子(圖3).在上述構建的基因整合平臺系統(tǒng)基因表達載體中,選用的cpc2啟動子和groESL啟動子不僅是強啟動子,而且分別受紅光和熱的誘導,處于這種啟動子控制下的外源基因必須在合適的誘導條件下才能表達.這樣的轉基因藍藻便于人工控制,即使進入自然環(huán)境中,由于不存在合適的誘導條件,不能表達外源基因產(chǎn)物,因此不會導致環(huán)境污染和影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡.可以認為這是一類安全的基因表達盒.4藍藻合成監(jiān)療藥利用上述構建的穿梭質(zhì)粒表達載體和基因整合平臺系統(tǒng),將人源胸腺素α1基因轉入Calothrixsp.PCC7601和Synechococcussp.PCC7942等藍藻,獲得了能表達人源胸腺素α1的轉基因藻株,表達量達可溶性蛋白質(zhì)的8%以上.胸腺素α1是一種由28個氨基酸組成的小肽,在臨床上廣泛用于治療原發(fā)性胸腺發(fā)育缺陷癥、自身免疫性疾病以及慢性乙肝和丙肝等多種疾病,與其他藥物并用對愛滋病和癌病有一定的療效,并且可以抗老防衰,口服有效.動物試驗表明,轉人源胸腺素α1基因藍藻Calothrixsp.PCC7601和Synechococcus