表觀遺傳學(xué)創(chuàng)新實驗

5’-氮胞苷處理水稻幼苗對基因組

DNA甲基化的影響

龐勁松劉寶

東北師范大學(xué)生物基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化DNA甲基化作用DNA的甲基化及其方式DNA甲基化的生物學(xué)意義DNA胞嘧啶甲基化的種類和形成DNA胞嘧啶甲基化檢測檢測方法：MSAP，bisulfitesequencing5’氮胞苷處理對水稻DNA甲基化的影響實驗?zāi)康膶嶒灢牧蟽x器試劑實驗方法5’-氮胞苷處理水稻幼苗植物基因組DNA的提取與純化基因組DNA酶切-連接接頭PCR擴增：預(yù)擴增，選擇性擴增PAGE電泳預(yù)期實驗結(jié)果注意事項與建議思考題參考文獻表觀遺傳學(xué)：不需要基因序列改變而產(chǎn)生的可遺傳的基因表達改變；主要包括DNA的甲基化修飾和組蛋白氨基酸的末端修飾。表觀遺傳變異包括:X－染色體失活、轉(zhuǎn)基因沉默、核仁顯性和基因組印記等方面。表觀遺傳變異的原因：是由于表觀遺傳密碼的改變，如DNA甲基化、組蛋白的公家修飾改變等。DNA甲基化：

在DNA復(fù)制后，經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DMT）催化，將S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基團連接到DNA分子腺嘌呤堿基或胞嘧啶堿基上，進行DNA修飾的過程。DNA甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化DAM(DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶)識別回文序列GATC,在此位置兩條鏈的腺嘌呤N-6位置上同時甲基化，同時SAM轉(zhuǎn)變?yōu)镾AH(S-腺苷高半胱氨酸)在DMT(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位點胞嘧啶C5被甲基化

DNA甲基化作用圖1胞嘧啶甲基化過程圖2腺嘌呤甲基化過程DNA甲基化的生物學(xué)意義影響基因表達狀態(tài)：通過該表基因調(diào)控區(qū)DNA甲基化程度調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄 圖3甲基化與基因沉默參與基因組防御：通過高度甲基化而使外源DNA（如轉(zhuǎn)座子）處于沉默狀態(tài)提高環(huán)境適應(yīng)能力：在不改變基因型的情況下產(chǎn)生可遺傳的新表型DNA胞嘧啶甲基化的種類和形成從頭甲基化(denovomethylation)DNMT3a，DNMT3b在完全沒有甲基化的DNA上加上甲基。維持甲基化(maintenancemethylation)Met1，DNMT1較特異地識別半甲基化狀態(tài)的DNA，負責(zé)在細胞分裂過程中依據(jù)DNA母鏈的甲基化狀態(tài)給新合成的DNA鏈上加上甲基。圖4兩種胞嘧啶甲基化方式

DNA胞嘧啶甲基化檢測方法使用對胞嘧啶5’-甲基化狀態(tài)敏感的限制性內(nèi)切酶進行酶切處理，然后檢測多態(tài)性：甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP,MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism)胞嘧啶轉(zhuǎn)化為其它堿基，然后對比測序：重亞硫酸鹽測序(Bisulfitesequencing)GCmTACT重亞硫酸鈉GCmTATT測序測序此外，還有單核苷酸法，甲基化接受力的檢測法，CpG島分離法和基因活性測量法，基因芯片法等

MSAP用途：最常用的大規(guī)模檢測基因組甲基化變異水平和位點的手段原理：利用對DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分別切割DNA，產(chǎn)生不同的酶切產(chǎn)物，同時將酶切產(chǎn)物添加接頭，然后進行PCR擴增、PAGE電泳、銀染，產(chǎn)生可見的具有不同酶切型式的譜帶，即可得知DNA甲基化信息。甲基化狀態(tài)分析：在不同泳道相對應(yīng)的位置上，如果MspI酶切產(chǎn)物有擴增帶、而HpaII酶切產(chǎn)物沒有擴增帶的，說明此處的序列是CCmGG；若都有擴增帶，說明此處是CCGG。還可以進一步對差異條帶進行切膠回收、克隆、測序，以便得知發(fā)生甲基化變化的胞嘧啶的具體位置。表1甲基化敏感酶對不同甲基化狀態(tài)DNA的切割結(jié)果原始序列內(nèi)切酶CCGGCCmGGCmCGGHpaIICCGG不切割不切割MspICCGGCCmGG不切割MSAP流程：

提取基因組DNA

（注意發(fā)育時期和成長狀態(tài)相同）

………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……

………TAGGCCACCGAACGGCCTG……

MspI酶切+接頭 HapII酶切+接頭ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC

ATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTG

TAGGCCACCGAACGGCCTG

PCR PCR

PAGE電泳 PAGE電泳MspI5’…CC(m)GG…3’3’…GGC(m)C…5’HpaII5’…CCGG…3’3’…GGCC…3’重亞硫酸鹽測序圖5重亞硫酸鹽測序原理5’氮胞苷處理對水稻DNA甲基化的影響實驗?zāi)康氖褂貌煌瑵舛鹊?’氮胞苷溶液，處理生長早期的水稻幼苗，使其基因組DNA胞嘧啶甲基化水平發(fā)生顯著的可遺傳改變，使用MSAP方法檢測DNA胞嘧啶甲基化水平的改變；水稻幼苗因DNA甲基化水平改變而影響基因表達水平，產(chǎn)生明顯的表觀遺傳表型。實驗材料水稻：日本晴(Oryzasativavarjaponica,nipponbare)

5’氮胞苷如何影響基因組DNA甲基化水平：5’氮胞苷可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DMT）結(jié)合從而抑制其活性，在DNA復(fù)制過程中抑制維持甲基化作用，使復(fù)制后的DNA甲基化水平降低。所需儀器離心機PCR儀氣浴搖床水浴搖床植物生長箱

電泳儀電泳槽微量移液器紫外分析儀分析天平

圖6所需主要儀器試劑植物基因組DNA改良CTAB提取液：bufferA:0.35mol/LSorbitol，0.1mol/LTris-HClpH7.5，0.5mmol/LEDTA;bufferB:0.2mol/LTris-HClpH7.5，0.05mol/LEDTA，2mol/LNaCl，2%CTAB;bufferC:5%N-lauroylsarcosinePCR試劑：TakararTaq，10XPCRbuffer，ddH2O，PCR引物預(yù)擴增引物： H/M+0:(5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′) EcoRI+0:(5′-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3′)選擇性擴增引物： H/M+AN:5′-GACTGCGTACCAATTCAA(T,C,G)-3′ EcoRI+AN:5′-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T,C,G)-3′。酶切-連接試劑：EcoRI(NEB)，HapII(NEB)，MspI(NEB)，T4DNAligase，T410xreactionbuffer接頭：EcoRIadapter:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ CATCTGACGCATGGTTAA HapII/MspIadapter:5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’ AGTACTCAGGACGAGCPAGE試劑：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚藍，銀染固定/終止液(10%冰乙酸)，染色液(2升雙蒸水預(yù)冷，用時加2克硝酸銀，3ml37%甲醛)，顯影液(2升雙蒸水中溶解60克碳酸鈉，冷卻至10-12oC，用時，加入3ml37%甲醛，400ul硫代硫酸鈉（10mg/ml）)。其它試劑：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸餾水，PVP(20%)，氯仿:異戊醇(24:1)，異丙醇，70%乙醇，RNA酶A(DNase-free)，TE，TAE，瓊脂糖，EB，未酶切的λDNA，1xTBE(0.089MTris-borate,0.089MBoricAcid,0.002MEDTA)，3xloadingbuffer(300mMNaOH,97%formamide,0.2%bromophenolblue)。實驗方法5’-氮胞苷處理水稻幼苗：26℃，暗培養(yǎng)(1)取水稻Nipponbare種子10粒X4組，分別置于90mm培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙上，加入15mL蒸餾水浸種24h；（第一天）(2)分為三個實驗組和一個對照組，實驗組分別用25mg/mL,50mg/mL,100mg/mL5’-氮胞苷溶液處理，對照組用蒸餾水培養(yǎng)，共處理10天，每天換處理液1次；（第二~十一天）圖75’-氮胞苷處理的水稻幼苗（右）和對照植株（左）植物基因組DNA的提取與純化改良CTAB法(KidwellandOsborn,1992) 不同處理的葉片1g

液氮中研磨成粉 轉(zhuǎn)入50ml離心管

加入等體積DNA提取緩沖液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)

65℃恒溫水浴搖床，40-50rpm振搖90分鐘 加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，輕輕上下顛倒10-15分鐘 4℃3000rpm離心10-15分鐘 上層水相

加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，上下顛倒5分鐘并置4℃冰箱內(nèi)10min DNA沉淀后于4℃3000rpm離心收集DNA于管底 DNA于70%乙醇中過夜。 DNA沉淀

（第十二天）

風(fēng)干DNA GenomicDNA 2mlEppendorf中加1mlTE溶解沉淀 待DNA完全溶解后，加入5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃保溫30 分鐘以除去DNA中的RNA。 加入等量氯仿:異戊醇(24:1)純化DNA，輕輕上下顛倒10-15分鐘 4℃3000rpm離心10-15分鐘 DNA沉淀 70%乙醇過夜洗滌DNA 溶于DNA于200-500μlTE中 GenomicDNA溶液 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA的質(zhì)量并據(jù)已知的DNAMarker （未酶切的λDNA）估計其濃度。 調(diào)整DNA濃度，置於-20℃?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA酶切-連接接頭甲基化分析采用兩種甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和連接前，先把兩個單鏈的接頭復(fù)性為雙鏈結(jié)構(gòu)(序列見試劑部分)，即100℃變性5分鐘,緩慢冷卻至室溫，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。水稻MSAP限制性酶切和連接體系如下：

T410xbuffer2.5μlBSA(10mg/L)0.1μlEcoRIadaptor(5pM)0.5μlH/Madaptor(50pM)0.5μlEcoRI(20U/μl)0.5μlH/MHpaII(20U/μl)0.25μlMspI(10U/μl)0.5μlT4ligase0.1μlGenomicDNA300ngAFLP-Water補足總反應(yīng)體積20μl混勻體系，37℃，6小時，8℃，4小時，4℃保存。共四個處理組，即Nipponbare25mg/mL處理組，Nipponbare50mg/mL處理組，Nipponbare100mg/mL處理組，Nipponbare對照組；每組分別用HapII/MspI酶切，共需切8管（第十五天）表2水稻MSAP限制性酶切、連接體系PCR擴增預(yù)擴增：水稻AFLP預(yù)擴增體系如右表(預(yù)擴增引物PCR引物部分)：混勻體系，按下列參數(shù)進行PCR擴增反應(yīng)：PCR程序：94℃預(yù)變性2min,94℃變性30秒，56℃復(fù)性30秒，72℃延伸60秒,共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。根據(jù)檢