第六章園藝植物的染色體工程第一頁，共五十七頁，2022年，8月28日植物染色體工程是按照一定的設計有計劃消減、添加和代換同種或異種染色體，引發(fā)產生各種整倍體變異和非整倍體變異，從而改良植物的遺傳基礎，培育符合人們需要的新種質或新品種的方法和技術。第二頁，共五十七頁，2022年，8月28日第一節(jié)

園藝植物單倍體的制備單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。制備園藝植物單倍體一般采用離體誘導法從具有單倍染色體數(shù)的性器官獲得植株。其中，雄配子途徑以雄性器官為外植體，經歷雄核發(fā)育（androgenesis）獲得單倍體；而雌配子途徑以雌性器官及其相關結構為外植體，經雌核發(fā)育（gynogenesis）獲得單倍體植株。第三頁，共五十七頁，2022年，8月28日一、雄配子途徑采用花藥或花粉培養(yǎng)（或游離小孢子），即離體培養(yǎng)花藥和花粉（小孢子），使小孢子改變原來的配子體發(fā)育途徑，轉向孢子體發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株，從中鑒定出單倍體并加倍成純合二倍體。第四頁，共五十七頁，2022年，8月28日離體條件下對植物的花粉或花藥進行培養(yǎng)（Pollen

Culture

and

Anther

Culture）獲得單倍體植株的技術最

是在1964年由印度植物學家Guha

和Maheshiwari在毛葉曼佗羅（Datura

innoxia)的花藥培養(yǎng)中成功獲得單倍體植株。目前已在250多種植物中由花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株。第五頁，共五十七頁，2022年，8月28日1.花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的基本程序:外植體的選擇----預處理----表面滅菌----接種----培養(yǎng)----再生植株-----單倍體鑒定----染色體加倍----獲得純合二倍體。第六頁，共五十七頁，2022年，8月28日第七頁，共五十七頁，2022年，8月28日（1）材料的表面滅菌與無菌操作：對花蕾進行表面滅菌，然后分離花藥和花粉。（2）花粉的分離與清洗：花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來．及時將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。第八頁，共五十七頁，2022年，8月28日機械分離法分離：把花藥放在玻璃容器中，加入一定量適當濃度的蔗糖溶液，加入適量液體培養(yǎng)基，用注射器內筒輕輕擠壓花藥把花粉擠出來?；蛴么帕嚢杵靼鸦ㄋ帞嚵咽够ǚ凵⒊鰜?。過篩：把上述的花藥殘渣和花粉的混合液經·一定孔徑的不銹鋼網或尼龍網過濾?；ǚ蹫V液注入離心管。清洗：花粉藥壁混合液置于100-1000轉／分的速度下離心1-5分鐘，上清液再離心，最后懸浮花粉。密度為104-105/ml。第九頁，共五十七頁，2022年，8月28日（3）花粉培養(yǎng)方式：直接培養(yǎng)法：不經預處理直接接種于培養(yǎng)基?？醋o培養(yǎng)法：花藥接種于培養(yǎng)基，上面放置一塊濾紙，花粉接種于濾紙上。微室培養(yǎng)法:蓋玻片上滴加一滴瓊脂，花粉接種在瓊脂上，反向放置于凹型載玻片上。第十頁，共五十七頁，2022年，8月28日第十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日2.雄核發(fā)育在適宜離體培養(yǎng)的條件下，花粉（或小孢子）的發(fā)育偏離活體時的正常發(fā)育而轉向孢子體發(fā)育，經胚狀體途徑或器官發(fā)生途徑形成完整植株，稱為雄核發(fā)育。第十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：小孢子第一次分裂為均等分裂（B途徑）形成大小相似的細胞，然后由單一類細胞形成多核花粉細胞（途徑

Ⅰ)。小孢子第一次分裂為不均等分裂(A途徑)：根據第二次及以后的分裂不同又分為A-V途徑（營養(yǎng)核分裂,途徑Ⅱ）、A-G（生殖核分裂，途徑Ⅲ）、A-VG（營養(yǎng)和生殖核均分裂，途徑Ⅳ）、C（分裂中出現(xiàn)融合加倍等現(xiàn)象）途徑等。第十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.第十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日第一次有絲分裂為不均等分裂.A.途徑（D.自然萌發(fā)）第十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日C途徑，在第一次不均等分裂后，營養(yǎng)核、生殖核同時核內復制第十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日Figure

-

Segmentation

pattern

of

invitrowheat

pollen

observed

from

the

1st

to

14th

day

of

anther

culture.

The

figure

shows

that

a

uninucleated

microspore

maydegenerate

before

division,

(a)

or

may

give

rise,

by

mitosis,

to

normal

binucleated

grain

presenting

vegetative

and

generative

nuclei

(b).

Identical

nuclei

are

formed

inlow

frequency

(c).

The

first

mitotic

division

occurs

at

the

4th

day

of

culture.

The

normal

binucleated

pollen

may

follow

the

normal

insitu

developmental

patternforming

starch

and

then,

degenerate

(d).

The

second

mitotic

division

takes

place

at

the

6-8th

and

at

the

10th

day

of

culture.

In

the

androgenetic

pollethe

vegetative,

generative

or

both

nuclei

are

able

to

divide

giving

rise

to

an

embryo

(e,

f,

g).

In

pollen

with

identical

nuclei,

both

cells

contributeandrogenesis

(h).

Pollen

degeneration

can

occur

in

any

step

of

this

process.

At

the

14th

day,

multicellular

structures

can

be

seen

(i).第十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日第二十頁，共五十七頁，2022年，8月28日花粉植株的誘導：胚狀體途徑直接形成胚狀體。愈傷組織途徑形成愈傷組織然后分化出不定芽等器官，最后發(fā)育成完整植株。第二十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第二十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日第二十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日第二十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日3.影響花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的主要因素供體植株基因型：植物屬間、種間、品種間可能存在一定的差異。小孢子發(fā)育時期：醋酸洋紅染色鏡檢花粉發(fā)育時期。大多數(shù)植物以單核后期花粉適宜花藥培養(yǎng)。供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。如木本植物幼齡植株比老齡誘導率高；始花期和盛花期比開花末期適宜；一二年生草本生長健壯且處于生殖高峰期的花粉花藥誘導率高。第二十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日第二十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s

染色單核期雙核期成熟花粉粒不同發(fā)育時期的煙草小孢子第二十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試

確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征

注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時期的確定第二十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日（4）預處理：花粉和花藥培養(yǎng)中材料的預處理方法有黑暗處理、光照處理、高滲處理（蔗糖、甘露醇等）、藥物處理（秋水仙素、乙稀利、EMS等）、溫度處理以及射線處理（r射線）等。溫度處理又包括低溫處理和高溫處理，接種前的處理和接種后的處理等，采用較多的方式是把取來的材料放在冰箱里3-10

℃下進行1-15天的低溫處理。也可采用接種后預處理的方法。第二十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日（5）培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基類型MS、Miller、Nitsh、H、N6、W14等。激素及生長調節(jié)劑早期要求生長素促進分裂，后期細胞分裂素促進花粉植株的形成。碳源及其他成分高濃度蔗糖等，要求較低的銨態(tài)氮、氨基酸等。溫度和光照：前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；分化階段光照有利于分化。接種方式和密度接種方向和密度影響小孢子離體形態(tài)發(fā)生。第三十頁，共五十七頁，2022年，8月28日不結球白菜小孢子培養(yǎng)第三十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日二、雌配子途徑植物胚囊中具有單倍性染色體構成的細胞在適當?shù)臈l件下可以發(fā)育成單倍體植株，這就是制備單倍體的雌配子體途徑，常用的方法是通過未授粉子房和未授粉胚珠培養(yǎng)?；虿捎闷渌椒ㄍㄟ^雌配子體途徑獲得單倍體。1980年成功培養(yǎng)了未授粉的非洲菊、煙草的胚珠，獲得了單倍體植株。第三十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日第三十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日第三十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日第三十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日1.未受精子房或胚珠培養(yǎng)的意義是以未受精子房或胚珠為外植體誘導單倍體的方法。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產生的過程。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。（1）目前部分植物花粉花藥培養(yǎng)技術尚未成功建立或誘導頻率過低，因此可以采用未受精子房或胚珠培養(yǎng)；對于雄性不育植物也可以采用該方法培養(yǎng)單倍體；未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；未授粉子房或胚珠培養(yǎng)再生植株穩(wěn)定；雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。第三十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日2.雌核發(fā)育胚囊中具有單倍性染色體構成的細胞都可以通過離體雌核發(fā)育產生單倍體植株，包括（1）助細胞或胚囊的無配子生殖產生單倍體；（2）卵細胞、助細胞和反足細胞發(fā)育產生單倍體；（3）非正常發(fā)育的大孢子四分體產生單倍體。第三十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日3.雌核發(fā)育的主要影響因素（1）基因型：培養(yǎng)難易程度受基因型影響。（2)供體植株的生理狀態(tài)：適宜生長條件下的供體植株，其未授粉子房和胚珠培養(yǎng)效果較好；生理年齡小，培養(yǎng)效果好。（3）胚囊發(fā)育時期：接近成熟階段的子房和胚珠易培養(yǎng)成功。第三十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日（4）培養(yǎng)基成分：植物激素授粉胚珠：細胞分裂素對胚發(fā)育通常有促進作用。未授粉胚珠：外源激素不利于向日葵孤雌生殖。矮牽牛未授粉胚珠培養(yǎng)不需激素，其他需要適當添加。有機物：添加有機附加物可以促進授粉胚珠的發(fā)育。蔗糖濃度：3-12%，通常5%，高濃度利于孤雌生殖。第四十頁，共五十七頁，2022年，8月28日第四十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第四十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日（5）培養(yǎng)條件：溫度以25℃為適宜，黑暗條件有利于雌核發(fā)育。（6）接種方向：花柄插入培養(yǎng)效果好。第四十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日第二節(jié)園藝植物多倍體的制備體細胞含有3個或3個以上染色體組的生物體稱為多倍體（polyploidy）。多倍體在植物形態(tài)和細胞上都表現(xiàn)明顯的巨大性、遺傳性較豐富，變異的范圍廣；對外界環(huán)境條件的適應性強，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍體強，但結實力多會下降。第四十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日人工誘導多倍體方法較多，如利用未減數(shù)配子（2n配子），采用物理方法（機械損傷、射線、溫度、高速離心）使染色體加倍；采用原生質體融合、胚乳培養(yǎng)等也可以獲得多倍體。采用化學方法誘導植物染色體加倍，常用的是秋水仙素（colchicine），具有阻礙紡錘絲形成和赤道板的產生而導致染色體加倍。此外抗微管形成的除草劑如氟樂靈（trifluralin）、氨磺靈（oryzalin）、APM等也具有染色體加倍功能。第四十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日A.浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。B.生長點處理秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。C.培養(yǎng)基處理將植株的任何一部分作為外植體，接種于附加一定濃度的秋水仙素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。第四十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日第四十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日第四十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日離體誘導影響因素：外植體：愈傷組織、種子、芽、莖尖分生組織、葉片、原球莖等均可；以生長旺盛時期為適宜。加倍劑的類型：秋水仙素、氨磺靈、氟樂靈等。加倍劑濃度和時間：高濃度短時間或低濃度長時間處理。加倍劑的加入時間：接種前浸泡處理或先獲得無菌材料再處理。助劑：如二甲基亞砜（DMSO）。第四十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日胚乳培養(yǎng)胚乳在被子植物中是雙受精的產物，由極核和雄配子結合成的三倍體組織。而裸子植物胚乳在受精前形成，為單倍體。僅40多種植物進行胚乳培養(yǎng)研究，20種獲得再生植株，如獼猴桃等。多存在混倍現(xiàn)象。第五十頁，共五十七頁，2022年，8月28日胚乳培養(yǎng)應注意的問題：確定適宜的發(fā)育時期（生長旺盛期）；嚴格區(qū)分胚乳和其他組織；合理使用激素；注意光、溫條件（24-280C；黑暗條件）。第五十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作生物體的核內染色體數(shù)不是染色體基數(shù)整數(shù)倍，而發(fā)生個別染色體增減的生物體稱為非整倍體（aneuploid）。非整倍體多不具有直接利用價值，但可以利用非整倍體進行染色體添加、消減、代換和易位，將帶有異源優(yōu)良基因的染色體或片段導入生物體中，從而達到定向改變遺傳特性，創(chuàng)造新類型和新品種的目的。第五十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日一、染色體代換系的創(chuàng)制生物體的染色體被異源種屬染色體所代換的品系稱為代換系，一條染色體被代換稱為單體代換系，一對染色體被代換稱為二體代換系，整套被代換稱為整套染色體代換系。常規(guī)法創(chuàng)制代換系采用單體法、缺體回交法和單端體法等。生物技術方法創(chuàng)制代換系主要是組織培養(yǎng)法，其中常用的是花藥（花粉）培養(yǎng)法。對遠緣雜種的花藥（或花粉）進行培養(yǎng)，再生植株中有可能鑒定出染色體代換系。第五十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日二、染色體附加系的創(chuàng)制將同種或異種的染色體導入受體中，這種染色體在受體中增加的技術叫做染色體附加。具有附加染色體的品種或品系叫附加系。導入一條或幾條異源種屬的染