fq-pcr檢測(cè)在兒童急性病毒性腦炎和腦膜炎中的應(yīng)用

由于急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病毒種類繁多，病變部位（腦、腦膜、髓質(zhì)、脊柱）的重量和重量不同，臨床表現(xiàn)各種。即使是同一病原在不同個(gè)體也有很大差別,況且其他病原體所致的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病或非感染性疾病亦可有相似的臨床表現(xiàn)而容易誤診。因此,病毒病原學(xué)診斷在臨床診斷和鑒別中尤為重要。但腦脊液(cerebrospinalfluid,CSF)病毒分離以及腦脊液特異性IgM抗體檢查的陽性率均不高。目前認(rèn)為用分子生物學(xué)方法檢測(cè)在CSF標(biāo)本中的病毒核酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染性疾病病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但國內(nèi)特別是采用FQ-PCR方法檢測(cè)CSF標(biāo)本的相關(guān)報(bào)道較少。因此本研究收集2010年7月~2011年10月因急性病毒性腦炎或腦膜炎在湖南省人民醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)中心住院的兒童CSF標(biāo)本,選用FQ-PCR方法,對(duì)EV、ADV、EBV、MuV、HHV-6、CMV、HSV-2、MV、HPeV、VZV、JEV、HSV-1進(jìn)行核酸檢測(cè),以求了解本地區(qū)兒童急性病毒性腦炎和腦膜炎的病毒病原譜構(gòu)成,為臨床診治提供參考依據(jù),為開展防治工作提供流行病學(xué)資料。1材料和方法1.1未診斷病例的醫(yī)療處理以2010年7月~2011年10月在湖南省人民醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)中心因急性病毒性腦炎或腦膜炎住院的兒童為研究對(duì)象,出院時(shí)未診斷的病例予以剔除。臨床疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)吳希如《小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床》第2版。標(biāo)本采集前征得患兒家屬知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。1.2實(shí)驗(yàn)步驟1.2.1低溫冰箱保存檢經(jīng)腰椎穿刺術(shù)留取CSF標(biāo)本約1mL,立即置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。所有標(biāo)本均予干冰低溫保存轉(zhuǎn)運(yùn)至中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。1.2.2pcr和測(cè)序根據(jù)文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)合成各病毒特異性引物及相應(yīng)TaqMan探針,提取陽性標(biāo)本核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析后進(jìn)行回收純化、連接、轉(zhuǎn)化、克隆及測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比較分析,測(cè)序正確后提取質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品。1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制各病毒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋成6~8個(gè)濃度梯度(100~107拷貝數(shù)/μL)后進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)束后以起始模板拷貝數(shù)的lg值對(duì)每個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.4dna病毒及dv、ebv、hhv、hsv、hsv、hsv、hsv、hsv、hsv、hsv、hsv、hsv、hsv采用FQ-PCR方法分別檢測(cè)CSF標(biāo)本中的RNA病毒(EV、HPeV、JEV、MeV、MuV)及DNA病毒(ADV、EBV、HHV-6、CMV、HSV-2、VZV、HSV-1)。查詢病歷資料后采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),P<0.05,認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1男女之比、年齡分布2010年7月~2011年10月共收集CSF樣本93份。其中男性53例,女性40例,男女之比為1.33∶1,年齡最小4月,最大13歲,平均年齡58.01±4.11個(gè)月。臨床診斷包括急性病毒性腦膜炎44例,急性病毒性腦炎27例,急性病毒性腦膜腦炎22例(在后續(xù)的統(tǒng)計(jì)資料中,急性病毒性腦膜腦炎歸類于急性病毒性腦炎),共93例。2.2csf病毒在急性病毒性腦炎和腦炎住院兒童中的發(fā)現(xiàn)和生長特征的特點(diǎn)2.2.1急性上?；貧w后各項(xiàng)病毒檢測(cè)結(jié)果93份腦脊液標(biāo)本中病毒檢測(cè)陽性36份,總檢出率38.71%(36/93);其中EV檢出最為常見,檢出率為24.73%(23/93),各病毒檢測(cè)陽性樣本數(shù)見表1。44例急性病毒性腦膜炎住院兒童CSF樣本18例檢出病毒,陽性檢出率為40.91%;49例急性病毒性腦炎住院兒童CSF中18例檢出病毒,檢出率為36.73%。兩者病毒檢出率之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.170,P=0.680)。2.2.2不同性別病毒陽性檢出率比較44例急性病毒性腦膜炎患兒中,男性20例,其中有6例CSF樣本檢出病毒,女性24例,12例樣本病毒檢出陽性,不同性別病毒陽性檢出率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.805,P=0.179),見表2。49例急性病毒性腦炎患兒中,男性33例,其中有14例在CSF標(biāo)本中檢出病毒陽性,女性16例,其中4例病毒檢出陽性,男女之間病毒陽性檢出率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(χ2=1.408,P=0.235)。2.2.3各年齡檢出率急性病毒性腦炎患兒CSF病毒檢出陽性的18例患兒中,5歲以上年齡段最常見,病毒陽性檢出的各年齡段分布比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.236,P=0.539),見表3。急性病毒性腦膜炎CSF病毒檢出陽性的18例病人中,1~5歲年齡段最常見,其次為5歲以上年齡段,各年齡段分布比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.237,P=0.888)。2.2.4不同季節(jié)和私家車壓監(jiān)測(cè)病毒的檢出情況總體看病毒的檢出以夏秋季為多,但是急性病毒性腦炎(χ2=2.554,P=0.110)與腦膜炎(χ2=0.000,P=1.000)各自的病毒檢出率在冬春季節(jié)及夏秋季節(jié)分布,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表4。2.2.5不同病毒的病毒pcr檢測(cè)此次研究發(fā)現(xiàn),有7份CSF標(biāo)本可同時(shí)檢出2種病毒,分別為EV+HHV-6、EV+ADV、EV+EBV、EV+MuV、ADV+EBV、MuV+HHV-6、ADV+CMV。2.2.6平均競(jìng)爭(zhēng)因素病毒檢出陽性病例腰椎穿刺留取CSF標(biāo)本距發(fā)病的時(shí)間最短為1天,最長為11天,平均為4.56±2.85天;病毒檢出陰性病例腰椎穿刺留取CSF標(biāo)本距發(fā)病的時(shí)間最短為1天,最長為14天,平均為6.01±3.08天;兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.546,P=0.123),見表5。3hhv感染年齡及發(fā)病情況本研究顯示,采用本實(shí)驗(yàn)建立的FQ-PCR方法對(duì)93例臨床診斷為急性病毒性腦炎或腦膜炎住院兒童的CSF標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),共有36份樣本檢出病毒,總檢出率38.71%(36/93),較大連的資料低,但較美國紐約的報(bào)道高。本研究急性病毒性腦炎的病毒陽性檢出率低于國外報(bào)道的42%。本資料急性病毒性腦膜炎的病毒陽性檢出率為40.91%,略低于伊朗報(bào)道的46.2%。本研究的檢出率與上述報(bào)道不太一致,考慮可能與地域、對(duì)象、檢測(cè)病毒種類的多少以及方法不同有關(guān)。大多數(shù)國家報(bào)道急性病毒性腦炎及腦膜炎的發(fā)病率有明顯的季節(jié)性,夏季多見且年齡段差異明顯。有文獻(xiàn)稱男性多于女性,這與本資料不符。本組資料中急性病毒性腦炎及腦膜炎各自病毒陽性檢出率在年齡段及季節(jié)分布上,無明顯差異,考慮與本研究病例數(shù)較少有關(guān),有待收集更多病例進(jìn)一步研究。EV系小RNA病毒科腸道病毒屬,國內(nèi)外不同地區(qū)的病原學(xué)研究結(jié)果均提示EV是兒童病毒性腦膜炎中最重要的病原,荷蘭學(xué)者采用FQ-PCR檢測(cè)232例病毒性腦膜炎的CSF,EV的檢出率為24.1%,本研究EV檢出率為24.73%,與上述報(bào)道一致。有人曾對(duì)100份中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病人的CSF采用FQ-PCR,檢出HPeV4例,年齡均小于4月。本研究?jī)H檢出1例,年齡為3歲。以往文獻(xiàn)記載ADV肺炎常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是中毒性腦病,卻忽視ADV腦炎、腦膜炎的存在。本資料中ADV檢出率為5.38%,大連為4.76%,紐約為0.2%,說明ADV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中占有一席重要地位。Dupuis等對(duì)病毒性腦炎和腦膜炎患者的CSF標(biāo)本進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè),檢出EBV85例,占3.6%。而我國北京報(bào)道1016例病毒性腦炎患兒血清標(biāo)本中有4例EBV特異性抗體陽性,但CSF抗體檢測(cè)未檢出陽性病例。本資料93例中檢出EBV4例陽性,與上述報(bào)道大致相似。我國北京地區(qū)腮腺炎腦炎主要集中在4~12歲,發(fā)病時(shí)間主要集中在冬春季。本資料檢出的3例MuV。7歲1例,5歲2例,與上述報(bào)道相似。檢出的3例病人中,僅一例有腮腺腫大,說明無腮腺腫大亦可能是MuV感染所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。HHV-6與許多疾病相關(guān)聯(lián),如:嬰幼兒皮疹,多發(fā)性硬化,癲癇,腦炎及無菌性腦炎等。有學(xué)者對(duì)紐約診斷為病毒性腦炎及腦膜炎患者的CSF進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè),其中HHV-6檢出21例,占0.9%,且大多數(shù)HHV-6感染病例的年齡小于2歲。我國有人運(yùn)用ELISA方法對(duì)北京地區(qū)病毒性腦炎患兒中的血清和CSF進(jìn)行檢測(cè),未檢出該病毒的特異性抗體。本資料檢出2例,其中5歲、7歲各1例,檢出率為2.15%。差異可能與檢測(cè)方法以及研究對(duì)象的年齡不同有關(guān)。紐約有學(xué)者采用FQ-PCR方法對(duì)2357份CSF標(biāo)本進(jìn)行研究,僅檢出10例CMV,占檢出病毒的0.4%。我國北京報(bào)道采用ELISA方法在病毒性腦炎患兒血清中檢出CMV抗體陽性8例,而在CSF中未檢出陽性病例。本研究CMV僅檢出2例,考慮免疫力正常人群感染CMV時(shí)急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病較少見。HSV感染呈世界性分布,是世界上引起病毒性腦炎最常見的病原體之一。徐子乾等對(duì)我國部分地區(qū)病毒性腦炎的病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在771份4~67歲患者的血清及CSF中,有44例HSV抗體陽性,檢出率為5.7%。而本研究HSV-2檢出2例,HSV-1未檢出,可能與HSV尚未在本地區(qū)流行有關(guān)。徐子乾等采用ELISA方法對(duì)病毒性腦炎進(jìn)行MV抗體檢測(cè)的檢出率僅為0.4%,本研究MV的檢出率為1.08%,可能與地區(qū)、檢測(cè)手段不同有關(guān)。國外的研究表明VZV在腦炎患者中的檢出率為10%~31%。北京報(bào)道在1016例病毒性腦炎患兒例腦脊液和血清中,僅血清檢出6例VZV特異性抗體陽性,但CSF中未檢出。本資料CSF標(biāo)本中未檢出VZV,考慮可能與疫苗的廣泛推廣,使該病毒所引起的相關(guān)疾病明顯減少可能有關(guān)。流行性乙型腦炎為全世界重要的病毒性腦炎,我國北京對(duì)2002~2005年病毒性腦炎兒童的血清及CSF的病毒特異性抗體研究表明,JEV檢出陽性22例,占2.9%。徐子乾等采用ELISA方法對(duì)771例臨床診斷為病毒性腦炎患者的急性