基于uplc-msms技術(shù)分析小柴胡湯化學(xué)成分及其在抑郁模型大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

小柴胡湯是東漢張仲景的《傷寒論》。它由柴胡、黃甘草、甘草、生姜和棗組成。小柴胡湯為和解少陽(yáng)而設(shè),具有解表散熱、疏肝和胃的功效。藥理研究和臨床實(shí)驗(yàn)表明小柴胡湯具有良好的抗抑郁療效,是治療抑郁癥的良方。劉曉帆等采用HPLC-TOF/MS法研究了小柴胡湯的化學(xué)成分,小柴胡湯在抑郁模型大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用UPLC-MS/MS技術(shù)分析小柴胡湯提取液化學(xué)成分以及抑郁模型大鼠ig給予小柴胡湯后血清和尿液中成分,闡明小柴胡湯化學(xué)成分組成及體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為揭示小柴胡湯抗抑郁作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。1藥品、藥品與試劑AcquityUltraPerformanceLCTM超高效液相色譜儀(Waters,美國(guó)),WatersQuattroMicroAPI三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配備電噴霧離子源、MassLynx4.1數(shù)據(jù)采集軟件(Waters,美國(guó)),LC—400低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司),AnkeTGL—16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司),L—128B型試管氮吹濃縮儀(北京來(lái)亨科貿(mào)有限公司)。甘草苷(批號(hào)111610-201106)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,黃芩素(批號(hào)111595-200905)、漢黃芩素(批號(hào)111514-200403)、人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-200322)、柴胡皂苷a(批號(hào)110777-200507)、黃芩苷(批號(hào)110715-200514)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。柴胡經(jīng)鑒定為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根,黃芩經(jīng)鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根,甘草經(jīng)鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖,半夏經(jīng)鑒定為天南星科植物半夏PinelliaternataBreit.的干燥塊莖,人參經(jīng)鑒定為五加科屬植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根,生姜經(jīng)鑒定為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖,大棗經(jīng)鑒定為鼠李科植物棗ZiziphusjujubeMill.的干燥成熟果實(shí)。以上藥材均購(gòu)自沈陽(yáng)同仁堂大藥房,由沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥用植物教研室路金才教授鑒定。乙腈(HPLC級(jí),Tedia公司,美國(guó)),甲酸(HPLC級(jí),Dikma公司,美國(guó)),純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);其余試劑為分析純。健康SD大鼠,體質(zhì)量250~350g,雄性,購(gòu)自沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(京)2009-0004。2方法2.1不同濃度的生藥液制備分別稱取柴胡12g、黃芩9g、人參9g、半夏9g、炙甘草6g、生姜6g、大棗6g,加入10倍量水,浸泡40min。武火煮沸后文火繼續(xù)煎煮30min,濾出藥汁。二煎,重新加入4倍量水至高出藥材約1cm,繼續(xù)武火煎煮至沸騰后改為文火煎煮30min,濾出藥汁。三煎同二煎。合并3次煎煮濾液,將3次濾液濃縮至總體積的一半,置冷凍干燥機(jī)內(nèi)制備成凍干粉,精確稱量所得凍干粉的質(zhì)量,得率為25.2%。將凍干粉置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存,備用。分析前,稱取凍干粉適量,加入一定體積的水進(jìn)行溶解,制得質(zhì)量濃度相當(dāng)于生藥50mg/mL的溶液。離心后取上清液,經(jīng)0.22μm濾膜濾過,取續(xù)濾液進(jìn)行LC-MS分析。2.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備分別取甘草苷、人參皂苷Rg1、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a對(duì)照品,各約10mg,分別置于10mL量瓶中,加入甲醇進(jìn)行溶解和定容,得到質(zhì)量濃度約為1mg/mL的各對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取甘草苷、人參皂苷Rg1、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a儲(chǔ)備液,體積分別為1、1、2、1、1mL置于10mL量瓶中,加入甲醇-水(50∶50)定容,得到混合對(duì)照品溶液。2.3生藥液的制備5只雄性SD大鼠,采用慢性不可預(yù)見性中等強(qiáng)度應(yīng)激刺激(CUMS)方法制備抑郁模型,連續(xù)刺激4周后模型成功。將小柴胡湯凍干粉用水溶解后制成相當(dāng)于生藥1g/mL的水溶液,按照生藥劑量5g/kgig給藥。每天給藥1次,連續(xù)給藥7d,末次給藥后將大鼠置于代謝籠中,禁食不禁水,收集0~24h尿液,所得尿液在3500r/min條件下離心10min,取上清,將其置于-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將大鼠從代謝籠中取出,ig給藥,于給藥后2h眼眶取血,置于離心管中,室溫靜置30min,在3500r/min條件下離心15min,取上清,即得血清,將其置于-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.4uplc-ms/ms分析吸取400μL血清,加入2倍量乙腈,渦旋1min,在13000r/min條件下離心10min,取上清1mL,40℃N2流下吹干,殘?jiān)?00μL乙腈-水(10∶90)復(fù)溶,渦旋30s,在13000r/min條件下離心5min,取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。2.5uplc-ms/ms分析分別取2mL甲醇和2mL水依次活化AgelacleanertC18SPE柱,取700μL尿液上樣于固相萃取小柱中,2mL水進(jìn)行淋洗,用1mL甲醇洗脫,收集洗脫液,40℃N2流下吹干,殘?jiān)?00μL乙腈-水(10∶90)復(fù)溶,渦旋30s,在13000r/min條件下離心5min,取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。2.6儀器和檢測(cè)條件色譜條件:ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm),體積流量0.2mL/min,柱溫20℃,進(jìn)樣室溫度4℃,進(jìn)樣量10μL,流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫:0~10min,95%~75%A;10~15min,75%~70%A;15~20min,70%~60%A;20~25min,60%~40%A,檢測(cè)波長(zhǎng)190~400nm。質(zhì)譜條件:ESI源;正負(fù)離子同時(shí)掃描;全掃描,掃描范圍m/z150~1500;毛細(xì)管電壓為3.0kV(ESI+),2.8kV(ESI-);錐孔電壓為25V;源溫度為120℃;脫溶劑氣為N2,脫溶劑氣溫度為450℃,脫溶劑氣體積流量為500L/h;錐孔氣體積流量為30L/h,碰撞氣為Ar。3結(jié)果3.1負(fù)離子質(zhì)譜圖檢測(cè)m/z33和400下未脫除3個(gè)氧小柴胡湯提取液化學(xué)成分色譜圖見圖1。在正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)的模式下,共檢測(cè)到44個(gè)成分。通過與對(duì)照品對(duì)照,確定了6個(gè)成分的結(jié)構(gòu);通過參考相關(guān)文獻(xiàn)中的質(zhì)譜一級(jí)、二級(jí)數(shù)據(jù)和色譜保留行為,共推測(cè)出38個(gè)成分的結(jié)構(gòu)。具體結(jié)果見表1。以43號(hào)色譜峰為例,說明化合物結(jié)構(gòu)鑒定過程。該色譜峰的正離子一級(jí)譜圖中出現(xiàn)m/z375和397離子峰,負(fù)離子一級(jí)譜圖中出現(xiàn)m/z373離子峰,見圖2。m/z375和373分別為[M+H]+和[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z375和373兩個(gè)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)掃描,發(fā)現(xiàn)正離子模式下出現(xiàn)360[M+H-CH3]+、345[M+H-2CH3]+、327[M+H-2CH3-H2O]+、227[M+H-C9H8O2]+的碎片離子,負(fù)離子模式下出現(xiàn)358[M-H-CH3]-、343[M-H-2CH3]-、328[M-H-3CH3]-、300[M-H-3CH3-CO]-的碎片離子,證明該化合物是至少含有3個(gè)甲氧基的黃酮類成分。黃酮類化合物易發(fā)生RDA重排,重排時(shí)C環(huán)上1-2位的C-O鍵和3-4位的C-C鍵發(fā)生斷裂(圖3),可以根據(jù)重排時(shí)脫去的中性碎片輔助判斷黃酮的結(jié)構(gòu)。正離子模式下m/z227的存在是由m/z375脫去148(C9H8O2)產(chǎn)生的,說明該黃酮B環(huán)上含有1個(gè)羥基和1個(gè)甲氧基。比較文獻(xiàn)中黃酮類成分的裂解規(guī)律,推測(cè)43號(hào)峰應(yīng)為黃芩新素II,結(jié)構(gòu)見圖3。3.2含藥歷史和代次研究空白血清和ig給藥后2h含藥血清樣品色譜圖見圖4。由于部分原形成分在含藥血清中濃度較低,很難在全掃描模式下被檢測(cè)到,故同時(shí)采用提取離子和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的方法對(duì)原形成分進(jìn)行分析。在含藥血清樣品中檢測(cè)到黃芩苷、千層紙素A-7-O-葡糖醛酸、三羥基-單甲氧基黃酮葡糖醛酸、黃芩素-6-O-葡糖醛酸、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A等7個(gè)原形成分。同時(shí),采用全掃描方式,對(duì)含藥血清樣品總離子流色譜圖中各色譜峰的碎片信息進(jìn)行解析,并將其與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),初步推測(cè)出8個(gè)代謝物(表2)。代謝產(chǎn)物M1和M2的譜圖中顯示m/z433[M+H]+的離子峰,m/z257碎片的出現(xiàn)是由母離子峰脫去176形成的,提示M1和M2應(yīng)該是某物質(zhì)的葡糖醛酸結(jié)合物,根據(jù)分子量信息推測(cè)可能是甘草素葡糖醛酸。對(duì)m/z257的碎片進(jìn)行分析,得到m/z137的碎片離子,與甘草素的碎片離子一致,推測(cè)M1、M2為甘草素葡糖醛酸結(jié)合物,但葡糖醛酸的結(jié)合位點(diǎn)不能確定。根據(jù)同樣的方法,推測(cè)代謝產(chǎn)物M3、M4、M5、M7和M8分別為漢黃芩素葡萄糖葡糖醛酸結(jié)合物、黃芩素二葡糖醛酸、漢黃芩素二葡糖醛酸、異甘草素葡糖醛酸和漢黃芩素-5-O-葡糖醛酸。代謝產(chǎn)物M6的譜圖中顯示653[M+H]+的離子峰,同時(shí)出現(xiàn)m/z477和301的碎片離子峰,提示M6應(yīng)該是某物質(zhì)的二葡糖醛酸結(jié)合物。對(duì)m/z301碎片離子進(jìn)行二級(jí)分析,得到m/z286,255,184的碎片離子,推測(cè)其為黃酮類成分,并且黃酮母核的B環(huán)上無(wú)取代基,但仍不能確定其母核結(jié)構(gòu),只能初步推測(cè)為三羥基-單甲氧基黃酮二葡糖醛酸。空白尿液和ig給藥后0~24h含藥尿液樣品色譜圖見圖4。比較空白尿液、含藥尿液和提取液樣品色譜圖,利用提取離子和MRM的方法,通過解析各色譜峰的碎片離子并與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,在含藥尿液樣品中檢測(cè)到黃芩苷、黃芩素-5-O-葡糖醛酸、千層紙素A-7-O-葡糖醛酸、白楊素葡糖醛酸、三羥基-單甲氧基黃酮葡糖醛酸、黃芩素-6-O-葡糖醛酸、漢黃芩苷、二羥基-二甲氧基黃酮葡糖醛酸、異漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A12個(gè)原形成分,并檢測(cè)到19個(gè)代謝產(chǎn)物,初步鑒定了其中18個(gè)的結(jié)構(gòu)。代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果見表3。4不同藥劑提取液未檢測(cè)到原形成分和代謝產(chǎn)物本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用UPLC-MS/MS法分析抑郁模型大鼠ig給予小柴胡湯提取液后血清中和尿液中的成分,為小柴胡湯抗抑郁作用的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。因?yàn)橐钟裟Ｐ痛笫蟮拇x可能與正常大鼠有差異,本研究采用CUMS法造成抑郁模型大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)更具實(shí)際意義。小柴胡湯水提液中多是黃酮類成分和皂苷類成分,并且黃酮類成分多以糖苷形式存在,其極性偏大,所以流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)選擇較大比例水相,可以使極性大的組分保留時(shí)間比較適宜?？疾炝思姿岷痛姿徜@作為水相添加劑,當(dāng)使用甲酸時(shí)各峰峰形得到優(yōu)化并且分離度得到改善。本方法在小柴胡湯提取液中未檢測(cè)到大棗和生姜中的成分,這可能與藥材提取方法或色譜和質(zhì)譜條件有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)給藥方案采用每天給藥1次,分別于連續(xù)給藥第7天和第8天收集尿液樣品和血清樣品,這種給藥方式可以使藥物在大鼠體內(nèi)積累達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度,從而便于分析含藥尿液和含藥血清中的原形成分及其代謝產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑郁模型大鼠ig給予小柴胡湯提取液后在血清和尿液中的代謝產(chǎn)物主要為II相代謝產(chǎn)物,并且大部分是葡糖醛酸結(jié)合物。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到小柴胡湯中主要是黃酮類成分,這類化合物都含有酚羥基,在體內(nèi)易與葡糖醛酸結(jié)合形成葡糖醛酸苷,使得代謝產(chǎn)物的水溶性增加,易于排出體外。同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清樣品中檢測(cè)到的全部原形成分也同時(shí)出現(xiàn)在尿液樣品中,血清中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物