小柴胡顆粒中柴胡皂苷的含量測(cè)定

“小柴胡”于2005年在中國(guó)經(jīng)典藥物版中公布，但與柴胡質(zhì)量控制方法不足。小柴胡方為和解劑的代表方,而柴胡和解表里、疏肝升陽,是小柴胡方的君藥;就“小柴胡顆粒”而言,柴胡的用量最大,已接近其他各單味藥用量的3倍。因此可以說柴胡是小柴胡顆粒中最為重要的組分。所以控制小柴胡顆粒中柴胡成分的含量對(duì)于控制小柴胡顆粒的質(zhì)量最有實(shí)際意義。柴胡主含揮發(fā)油、皂苷類成分,特別是皂苷類成分,2005年版中國(guó)藥典“柴胡”項(xiàng)下已作為藥材理化鑒別的主要依據(jù)之一。根據(jù)“小柴胡顆?！钡闹苿┕に嚳芍?“小柴胡顆?！睕]有刻意保留揮發(fā)油的工藝條件,這與《傷寒論》中“小柴胡湯”的制法相吻合,符合遵古制作指導(dǎo)思想,因而制劑中柴胡揮發(fā)油類成分保留較少,成品中可以不予考慮。但柴胡皂苷類成分在制劑工藝中得到了充分提取,成品中也應(yīng)得到充分體現(xiàn)。因此制劑中以柴胡皂苷類成分作為柴胡的質(zhì)量控制指標(biāo)具有一定的合理性。然而,在柴胡皂苷類成分中,其主成分柴胡皂苷a和d因其分子中環(huán)氧結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性導(dǎo)致在制劑工藝過程中大量轉(zhuǎn)化,以致一些制劑成品中已經(jīng)不能檢出此兩皂苷。另就“小柴胡顆?！钡默F(xiàn)行提取工藝而言,尚無可靠手段完全防止或有效控制柴胡皂苷a和d的轉(zhuǎn)化速度和程度。從而在客觀上造成了“小柴胡顆粒”制劑中某1種或2種柴胡皂苷含量的不確定性。所以,在柴胡制劑中僅測(cè)定某1種柴胡皂苷的含量對(duì)其質(zhì)量控制意義不大。這也是目前眾多柴胡制劑中沒有柴胡皂苷定量控制方法的主要原因之一。研究結(jié)果已經(jīng)闡明,柴胡皂苷a和d分子中的環(huán)氧鍵斷裂后,分別轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b1和b2,在沒有藥理研究結(jié)果能夠證明哪種柴胡皂苷就是小柴胡顆粒的有效成分之前,我們探索性地把柴胡制劑中的幾種主要柴胡皂苷成分的總和作為制劑中柴胡的質(zhì)量控制指標(biāo)。本文采用薄層掃描法同時(shí)測(cè)定小柴胡顆粒中柴胡皂苷a(d)、b2(b1)的含量,方法簡(jiǎn)單快速,能耗低,專屬性強(qiáng),結(jié)果可靠。并以四者之和作為含量評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)市售商品“小柴胡顆粒”的質(zhì)量狀況進(jìn)行比較,具有較強(qiáng)的針對(duì)性。為小柴胡顆粒中的柴胡皂苷含量評(píng)價(jià)方法提供一點(diǎn)方法思路和試驗(yàn)依據(jù)。1儀器、設(shè)備和分析方法CamagTLCScanner3型薄層掃描儀、CamagLinomat5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀:瑞士卡瑪;BP211D型電子天平:北京賽多利斯儀器公司;高效硅膠G薄層板:天津思利達(dá)色譜技術(shù)有限公司;離心機(jī)(500~4000r·min-1);HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋;KQ2200B型超聲波清洗器。柴胡皂苷a(110777-200406,供含量測(cè)定用):中國(guó)藥品生物制品檢定所,柴胡皂苷b2:自提,含量96%。小柴胡顆粒:市售商品。柴胡飲片:購(gòu)于北京同仁堂藥房,經(jīng)鑒定,符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。試劑均為分析純。2溶液的制備2.1混合對(duì)照品溶液分別精密稱取經(jīng)40℃、五氧化二磷、真空干燥處理12h的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2各6~7mg,置同一10mL量瓶中,并加甲醇定容至刻度,搖勻,即得每1mL含柴胡皂苷a、b2各0.6~0.7mg的混合對(duì)照品溶液。2.2正丁醇萃取液配制精密稱取小柴胡顆粒3g,置事先裝有3mL水的具塞離心管中,振搖使溶解。加正丁醇3mL,振搖萃取10min,離心(2000r·min-1)3min,吸取上層正丁醇萃取液,另存?zhèn)溆谩Ｏ聦右豪^續(xù)用正丁醇如法萃取3次,合并正丁醇萃取液,用氫氧化鈉試液洗滌2次,每次2mL,離心(2000r·min-1)3min,分取下層氫氧化鈉洗液(上層正丁醇溶液備用),合并,用正丁醇5mL振搖萃取10min,離心(2000r·min-1)3min,吸取正丁醇溶液,并與前面正丁醇溶液合并,水浴蒸干,殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。2.3陰性樣品溶液的制備按中國(guó)藥典2005年版“小柴胡顆?！表?xiàng)下【處方】的1/10量備料,按【制法】項(xiàng)下方法制成不含柴胡的小柴胡顆粒陰性樣品粉末(未制粒),并按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。2.4柴胡溶液2.4.1黑胡椒干浸膏稱取柴胡飲片適量,按照“小柴胡顆?！敝苽涞姆椒ㄖ苽涑刹窈山?。取柴胡干浸膏適量,按照供試品溶液的制備方法制備成柴胡飲片溶液(煎煮,0.1g·mL-1)。2.4.2胡椒飲片甲醇提取溶液0.1gml-1稱取柴胡飲片1g,置于15mL的具塞試管中,加入甲醇10mL,超聲(100W,40kHz)提取30min,離心(2000r·min-1)3min,吸取上清液至10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,即得柴胡飲片甲醇提取溶液(0.1g·mL-1)。3%對(duì)二甲氨基苯甲醛的溶液高效硅膠G薄層板;展開劑:三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶1);展距:8~9cm;展開后熱風(fēng)吹干。顯色劑:2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液;顯色方法:把薄層板浸入顯色劑0.5s后,取出,瀝干多余的顯色劑,于烘箱中60°C加熱5min,立即用干凈的2塊玻璃(20mm×10mm)夾封,并用膠帶將其固定。薄層掃描條件:單波長(zhǎng)吸收掃描,λ=538nm,光束狹縫6.0mm×0.45mm,測(cè)定供試品吸光度積分值和對(duì)照品吸光度積分值。4供試品色譜參數(shù)吸取供試品溶液10μL,按照上述薄層色譜條件試驗(yàn),以儀器給出各峰特征參數(shù)(Rf值)進(jìn)行計(jì)算,供試品色譜中,柴胡皂苷a(d)與柴胡皂苷b2(b1)分離度為1.21,符合中國(guó)藥典規(guī)定(圖1-B)。5提取法見表1分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液、柴胡皂苷混合對(duì)照品溶液各10μL;柴胡飲片溶液(煎煮提取)、柴胡飲片溶液(超聲提取)各5μL點(diǎn)于同1張薄層板上,如法展開、顯色、掃描。結(jié)果顯示陰性樣品溶液色譜中分別在柴胡皂苷a、b2相應(yīng)的位置上未見干擾吸收(見圖1-C)。6同一硅膠g薄層板上,4.3.4%,5.2,4.43精密吸取柴胡皂苷混合對(duì)照品溶液1mL于10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。分別精密吸取0.4,0.8,1.6,3.2,6.4μL依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,展開,顯色,掃描。結(jié)果顯示在點(diǎn)樣低于0.8μL時(shí)柴胡皂苷a色譜峰不能獲得積分值,在點(diǎn)樣低于1.6μL時(shí)柴胡皂苷b2色譜峰不能獲得積分值,因而柴胡皂苷a、b2的最低檢出量分別為52,106ng。7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取柴胡皂苷混合對(duì)照品溶液2,4,6,8,10μL點(diǎn)于同一薄層板上,每量2點(diǎn),依量循環(huán)點(diǎn)樣,展開,顯色,掃描測(cè)定。以點(diǎn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果各得1條直線。柴胡皂苷a、b2的回歸方程分別為:Y=2.23×103X+5.2×102r=0.996Y=2.80×103X+7.7×102r=0.999線性范圍分別為1.30~6.50μg,1.32~6.61μg。因?yàn)椴窈碥誥和b2的線性回歸方程皆不經(jīng)過原點(diǎn),故在含量測(cè)定時(shí)采用外標(biāo)二點(diǎn)法。8精密度測(cè)試8.1柴胡皂苷檢測(cè)取同一供試品溶液在同一薄層板上點(diǎn)樣6個(gè)點(diǎn),每點(diǎn)10μL,如法展開,顯色,掃描測(cè)定,得柴胡皂苷a(d)、柴胡皂苷b2(b1)峰面積的RSD分別為1.2%,0.43%。8.2空液回收的柴胡皂苷檢測(cè)取同一供試品溶液在不同的6塊薄層板上各點(diǎn)2個(gè)點(diǎn),每點(diǎn)10μL,如法展開,顯色,掃描測(cè)定,取每板掃描結(jié)果的均值,計(jì)算得柴胡皂苷a(d)、柴胡皂苷b2(b1)峰面積的RSD分別為2.2%,1.6%。9穩(wěn)定性試驗(yàn)9.1薄層顯色穩(wěn)定性吸取供試品溶液點(diǎn)于薄層板上,如法展開、顯色后,薄層板立即用潔凈玻璃夾封并用膠帶固定好后立即置掃描儀中掃描測(cè)定。并在第1次掃描測(cè)定后,每隔10min重復(fù)掃描測(cè)定含量1次,結(jié)果表明在1h內(nèi)薄層顯色穩(wěn)定,柴胡皂苷a(d)的RSD=1.4%;柴胡皂苷b2(b1)的RSD=2.4%。9.2柴胡皂苷ad、bb及其他a/d的量測(cè)取新制備的供試品溶液點(diǎn)于薄層板上,如法展開,顯色,掃描測(cè)定。之后每隔8h重復(fù)點(diǎn)樣、展開、顯色、掃描,測(cè)定柴胡皂苷a(d)、b2(b1)的含量1次,結(jié)果表明在48h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定,柴胡皂苷a(d)的RSD=2.6%;柴胡皂苷b2(b1)的RSD=3.8%。10苷ad的含量精密稱取同一批號(hào)的小柴胡顆粒,按照“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液,平行操作6份,分別依法測(cè)定含量,柴胡皂苷a(d)的含量分別為0.142,0.154,0.149,0.161,0.145,0.151mg·g-1,平均值為0.150mg·g-1,RSD為3.3%。柴胡皂苷b2(b1)的含量分別為0.153,0.145,0.164,0.161,0.151,0.158mg·g-1,平均值為0.155mg·g-1,RSD為3.6%。11對(duì)照品溶液的制備取已知柴胡皂苷含量的小柴胡顆粒1.5g,共6份,精密稱定后加入適量的柴胡皂苷對(duì)照品溶液。按照供試品溶液的制備方法制備得加樣回收試驗(yàn)溶液,如法測(cè)定含量。結(jié)果見表1。12供試品溶液及檢測(cè)分別精密吸取供試品溶液10μL、混合對(duì)照品溶液2及10μL,交叉點(diǎn)于同一薄層板上,各點(diǎn)2點(diǎn)。如法展開、顯色、掃描,按各皂苷峰面積的平均值計(jì)算供試品中各柴胡皂苷的含量。結(jié)果見表2。13氣相色譜質(zhì)譜分析13.1柴胡皂苷的含量測(cè)定方法有薄層掃描法、HPLC法、HPLC-ELSD法等,這些方法見報(bào)的多為單組分測(cè)定或柴胡藥材中柴胡皂苷含量的測(cè)定。用HPLC法測(cè)定復(fù)方制劑中柴胡皂苷的含量時(shí),由于柴胡皂苷僅有末端吸收,且干擾成分與柴胡皂苷很難達(dá)到基線分離,影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究用薄層掃描法同時(shí)測(cè)定柴胡皂苷a和d、b1和b2含量,雜質(zhì)干擾小,皂苷間分離度較好。本方法操作快速簡(jiǎn)便,且對(duì)儀器要求不高,其薄層色譜圖可用作小柴胡顆粒中柴胡皂苷快速鑒別的依據(jù)。13.2柴胡皂苷a和d互為異構(gòu)體,具有解熱、抗病毒、抗炎、降血脂、護(hù)肝等生理活性。柴胡皂苷b1和b2由柴胡皂苷a和d轉(zhuǎn)化而來。本方法選擇的展開劑,可使柴胡皂苷a和d、b1和b2在色譜中分別重疊為1個(gè)斑點(diǎn)(見圖1),即柴胡皂苷a和d形成1個(gè)斑點(diǎn)、b1和b2形成1個(gè)斑點(diǎn),且2個(gè)斑點(diǎn)分離良好,這樣可用柴胡皂苷a、b2對(duì)照品為對(duì)照,同時(shí)測(cè)定柴胡皂苷a和d、b1和b2的含量,方法簡(jiǎn)單,省時(shí)低耗。但實(shí)際制劑中柴胡皂苷a和d、b1和b2的比例是不確定的,當(dāng)對(duì)照品只使用其中1種時(shí),由于柴胡皂苷a和d、柴胡皂苷b1和b2對(duì)各自色譜的貢獻(xiàn)可能不盡相同,因此測(cè)定誤差在理論上仍然存在。本方法測(cè)得柴胡皂苷a和d的總量應(yīng)是以柴胡皂苷a計(jì)的量[表示為:柴胡皂苷a(d)],柴胡皂苷b1和b2的總量應(yīng)是以柴胡皂苷b2計(jì)的量[表示為:柴胡皂苷b2(b1)]。13.3對(duì)2個(gè)對(duì)照品