高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定蝦中9種磺胺類抗生素殘留

磺胺類藥物（sas）是一種含有氨基丙烯酸的藥物的總稱，也是一種常見的光譜抗生素。因其具有抗菌譜廣、高效、低毒和價(jià)格低廉等特點(diǎn),在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用。人類經(jīng)常食用有磺胺類藥物殘留的動物源性食品,就可能引起磺胺類藥物在體內(nèi)的逐漸累積,其危害性主要表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌作用以及激素樣作用等。目前中國、歐盟、美國、日本等均將磺胺類藥物列為動物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物,其最大殘余限量一般為50~100μg/kg。目前,用于抗生素的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、氣相色譜法(GC)、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等方法。本文采用高效液相色譜-質(zhì)譜法,建立檢測蝦中9種磺胺類藥物殘留的方法。1材料和方法1.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制液相色譜儀(配有四元泵,Agilent公司),質(zhì)譜檢測器(API3000,AB公司),液相色譜柱(菲羅門GeminiC18,5μm,4.6×150mm),組織搗碎機(jī),電子分析天平(感量為0.01g,上海梅特勒公司),渦旋混合器(德國IKA公司),超聲波清洗機(jī),冷凍離心機(jī)(SIGMA公司),0.45m有機(jī)微孔濾膜。乙腈、甲醇、異丙醇、正己烷和醋酸銨為色譜純(美國TEDIA公司);無水硫酸鈉(經(jīng)650℃灼燒4h,置于干燥器皿內(nèi)備用)為分析純;水為去離子水。磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑均來自于德國Dr.公司。標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制(400μg/ml):分別準(zhǔn)確稱取磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑10.0mg(準(zhǔn)確至0.1mg),置于25ml容量瓶,用少量甲醇溶解,并用甲醇定容至刻度,混勻,濃度為400μg/ml濃度,置于4℃冷藏避光保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲備液:分別準(zhǔn)確量取1.000ml9種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇定容至100ml,濃度為40μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)中間液,置于4℃冷藏避光保存。1.2樣品前處理1.2.1樣品的制備1.2.2操作工藝準(zhǔn)確稱取樣品5.00g于50ml離心管中,加入約10g無水硫酸鈉,渦旋混勻;加入20ml乙腈提取液,渦旋混勻2min;4000rpm離心5min,取上層清液,再次加入10ml乙腈提取液,渦旋混勻2min;4000rpm離心5min,合并上層清液,加入2ml異丙醇,于40℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入1.00ml乙腈+水(10∶90),渦旋后再加入0.5ml正己烷渦旋,轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管,15000rmp離心5min,取下層溶液過0.45μm有機(jī)濾膜到進(jìn)樣瓶中,供液相色譜-質(zhì)譜儀測定。1.3分析條件1.3.1醋酸銨溶液樣品2色譜柱:菲羅門GeminiC18,5μm,4.6×150mm或相當(dāng)者;進(jìn)樣量:50μl;柱溫:30℃;流動相:A相為乙腈、B相0.50mmol/L醋酸銨溶液;流速:0.80ml/min;梯度洗脫條件見表1。1.3.2氮?dú)庠谄?、困境b大氣電噴霧離子源ESI,正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);離子源噴霧器電壓(IS):5500V;離子源溫度:450℃;簾氣0.4MPa、霧化氣0.6MPa、輔助加熱氣0.7MPa、碰撞氣0.4MPa均為高純氮?dú)?使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。2結(jié)果與討論2.1結(jié)果2.1.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制配制濃度為0.0、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0ng/m的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按設(shè)定色譜條件進(jìn)行線性分析,以溶液濃度(ng/ml)為X,對峰面積為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,各種化合物的質(zhì)量濃度在0~100ng/ml范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。2.1.2檢出限的測定在5μg/kg添加水平時(shí),各藥物峰的信噪比均大于3,故將其定為檢出限。在10μg/kg添加水平時(shí),各藥物峰的信噪比均大于10,且回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)滿足條件,故將其定為定量限。2.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取、凈化及色譜分析以陰性蝦為基質(zhì),分別向其中加入5μg/kg和10μg/kg濃度的磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行提取、凈化及色譜分析。每個(gè)添加水平作6份平行測定,結(jié)果表明:平均回收率為75.3%~95.6%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%~13.5%;結(jié)果見表2。2.2討論2.2.1氯甲烷提取以乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷作為提取劑,在同一添加水平和相同試驗(yàn)條件下:經(jīng)乙酸乙酯提取檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶、磺胺喹惡唑等回收率低,且提取液也將樣品中大量脂肪帶入,使凈化難。二氯甲烷提取液渾濁,凈化難度大。乙腈提取效率最高,脂肪帶入少,易凈化,但是由于樣品組織中水較多,導(dǎo)致濃縮效率低,因此在加入乙腈前,先加入無水硫酸鈉除水。為使其蒸發(fā)效率加快,加入異丙醇可使乙腈旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)避免爆沸,在定容后再加少量正己烷除去剩余脂肪。2.2.2色譜條件優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了sas的分離流動相的pH值對SAs的分離和保留具有顯著的影響。實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度的甲醇乙酸、甲酸與乙腈配比梯度洗脫,比較發(fā)現(xiàn)乙腈、0.50mmol/L醋酸銨溶液為流動相,可以保證理想的分離度,同時(shí)配上合適的梯度淋洗條件,較好地實(shí)現(xiàn)了SAs的分離,9種磺胺類藥物均能達(dá)到基線分離,峰形尖銳,峰對稱性好。2.2.3[m+h]+離子譜圖根據(jù)磺胺藥物的分子結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)表明:磺胺在離子源ESI+電離方式下,通過全掃描確定[M+H]+離子峰,分別以此為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,找出二級質(zhì)譜中兩個(gè)信號最強(qiáng)的碎片離子,以母離子和子離子組成監(jiān)測離子對,見表2。以MRM的方式對樣品進(jìn)行定性和定量分析,如圖1所示。3高效液相色譜法檢測本方法以乙腈-0.50mmol/L醋酸銨溶液為流動相,采用離子源ESI+;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)檢測