HPV分型檢測(cè)

在宮頸疾病檢查中的應(yīng)用及亞能HPV基因

分型檢測(cè)HPV分型檢測(cè)

在宮頸疾病檢查中的應(yīng)用及亞能HPV基因

分型1HPV發(fā)展進(jìn)程70年代德國(guó)人哈拉爾德·楚爾·豪森提出人乳頭瘤病毒與宮頸癌有關(guān)系2019年國(guó)際癌癥學(xué)會(huì)確定：人乳頭瘤病毒是宮頸癌的主要病因。2019年10月6號(hào)哈拉爾德·楚爾·豪森獲得諾貝爾獎(jiǎng)。HPV發(fā)展進(jìn)程70年代德國(guó)人哈拉爾德·楚爾·豪森提出2宮頸癌生物學(xué)病因研究的進(jìn)程宮頸癌生物學(xué)病因研究的進(jìn)程3子宮頸癌唯一病因明確唯一可以早期發(fā)現(xiàn)和治療唯一可望消滅HPV感染，特別是高危性、持續(xù)性感染引起子宮頸癌前病變，子宮頸上皮內(nèi)瘤變，CIN和宮頸癌預(yù)防HPV感染就可以預(yù)防宮頸癌沒(méi)有HPV感染就可以不罹患宮頸癌子宮頸癌唯一病因明確4我國(guó)宮頸癌流行現(xiàn)狀我國(guó)婦女患宮頸癌的比例15/10萬(wàn)，是僅次于智利的宮頸癌高發(fā)國(guó)家目前患者約40萬(wàn)，每年新增15萬(wàn)，據(jù)女性生殖道腫瘤首位我國(guó)的宮頸癌死亡率為11.34%，據(jù)女性癌癥死亡率第二位，特別在西部地區(qū)，宮頸癌居女性癌癥死亡率之首我國(guó)已婚女性HPV感染率在10%左右。我國(guó)需驚醒宮頸癌相關(guān)篩查的適齡女性，不少于1億我國(guó)宮頸癌流行現(xiàn)狀我國(guó)婦女患宮頸癌的比例15/10萬(wàn)，是僅次5HPV病毒學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)

小環(huán)狀雙鏈DNA病毒2.直徑

50-55nm3.癌基因E6E7HPV病毒學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)小環(huán)狀雙鏈DNA病毒61466低危型HPV高危型HPV1466低危型HPV高危型HPV7HPV16L1:主要衣殼蛋白，是疫苗的主要成分L2:次要衣殼蛋白，是市售抗體的主要識(shí)別位點(diǎn)E4：結(jié)合并破壞細(xì)胞角蛋白網(wǎng)，形成挖空細(xì)胞的外觀E2：負(fù)性調(diào)節(jié)E6和E7，維持凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控。通常在病毒發(fā)生整合（病毒整合時(shí)會(huì)破壞E2基因的結(jié)構(gòu)）時(shí)失活HPV的主要致癌基因

E6通過(guò)抑制p53而阻斷凋亡E7通過(guò)抑制pRB使細(xì)胞周期失控XHPV16L1:主要衣殼蛋白，是疫苗的主要成分L2:8生殖道HPV感染

高危型HPV感染通常沒(méi)有癥狀，為一過(guò)性并可自愈。90%以上的病人兩年內(nèi)可痊愈。

常見(jiàn)其他亞型繼發(fā)或并發(fā)感染

——多重HPV亞型感染極為常見(jiàn)自然免疫力差–感染后只有50%-60%的女性產(chǎn)

生抗HPV抗體，因此對(duì)同種基因型的HPV可再度

感染！生殖道HPV感染9E6&E7E2良性濕疣在上皮分化的終末階段L1&L2開(kāi)始表達(dá)，并組裝形成病毒衣殼→最后完整的病毒顆粒從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)大量E4聚集→溶解細(xì)胞骨架蛋白→呈現(xiàn)挖空細(xì)胞的外觀低水平表達(dá)，以維持病毒基因組和細(xì)胞的生長(zhǎng)

負(fù)性調(diào)節(jié)

E6&E7

保持細(xì)胞的分

化和成熟

確保能夠產(chǎn)生

完整的病毒顆

粒一過(guò)性HPV感染E6&E7E2良性濕疣在上皮分化的終末階段一過(guò)性HPV感10E6&E7在細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)喪失分化的能力→不同程度的細(xì)胞不成熟性DNA多倍體的出現(xiàn)→核的非典型性持續(xù)的增生能力→分裂相增多高級(jí)別

CIN

蛋白表達(dá)水平增高凋亡被阻斷、細(xì)胞周期失控細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生惡變?cè)诓《菊蠒r(shí)被破壞持續(xù)性HPV

感染E2E6&E7在細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)高級(jí)別CIN蛋白表達(dá)水平增高在11

宮頸癌防治現(xiàn)狀宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，也是嚴(yán)重影響婦女身心健康，威脅婦女生命的重要原因之一。流行病學(xué)的調(diào)查顯示，從50年代以來(lái)，由于子宮頸細(xì)胞學(xué)的廣泛應(yīng)用，全球子宮頸癌的發(fā)病率明顯下降，但在發(fā)展中國(guó)家仍居?jì)D科惡性腫瘤首位調(diào)查數(shù)字顯示：我國(guó)25歲以上的婦女中，有超過(guò)70％的人

數(shù)從未做過(guò)宮頸防癌檢查?。。m頸癌防治現(xiàn)狀宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，也12hpv培訓(xùn)課件13hpv培訓(xùn)課件14篩查的重要性宮頸癌篩查不只是醫(yī)師行為，更是政府的職責(zé)，是艱難的系統(tǒng)工程我國(guó)目前不可能做到像美國(guó)、澳大利亞那樣建立規(guī)范化的篩查制度可以根據(jù)各地情況做區(qū)域性篩查，定點(diǎn)篩查，機(jī)會(huì)性篩查所有到婦產(chǎn)科門診就診者和各種體檢者，都應(yīng)做子

宮頸細(xì)胞學(xué)檢查/HPV檢查，這需要婦產(chǎn)科醫(yī)生的工

作之一

高危人群者更應(yīng)行定期的檢查和隨診篩查的重要性宮頸癌篩查不只是醫(yī)師行為，更是政府的15篩查的目的是識(shí)別和檢出子宮頸癌前病變，而不是子宮頸癌；子宮頸癌多半有癥狀，是及時(shí)診斷問(wèn)題子宮頸癌在癌前病變未被診斷，是沒(méi)有進(jìn)行檢查和篩查：

1/4患者從未進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查

1/4患者子宮頸癌前5年未進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查篩查的準(zhǔn)確性取決于：篩查方法的敏感性、特異性細(xì)胞學(xué)和HPV檢查質(zhì)量

篩查的目的是識(shí)別和檢出子宮頸癌前病變，而不是子宮頸癌；16子宮頸癌合并妊娠，是非常棘手的妊娠合并癥。準(zhǔn)備懷孕時(shí)仍要按照規(guī)范進(jìn)行定期的細(xì)胞學(xué)檢查。如孕前有高危因素，建議孕期及產(chǎn)后定期做宮頸細(xì)胞學(xué)檢查。懷孕過(guò)程中若出現(xiàn)異常癥狀至醫(yī)院就診，由醫(yī)生根據(jù)情況決定是

否進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查以及如

何處理。妊娠期也應(yīng)進(jìn)行宮頸癌篩查子宮頸癌合并妊娠，是非常棘手的妊娠合并癥。妊娠期也應(yīng)17篩查應(yīng)從何時(shí)開(kāi)始？性生活開(kāi)始后3年左右不晚于21歲PracticeGuidelinesinOncology,2019,NCCN篩查應(yīng)從何時(shí)開(kāi)始？PracticeGuide18何時(shí)終止篩查？年齡>70歲，在10年內(nèi)已有3次以上之滿意的細(xì)胞學(xué)檢查正常者，可停止篩查。但若無(wú)上述篩查歷史，或有不正常者，則建議繼續(xù)篩

查。有宮頸癌歷史、雌激素暴露、免疫功能障礙

（HIV＋），應(yīng)繼續(xù)長(zhǎng)期篩查。PracticeGuidelinesinOncology,2019,NCCN何時(shí)終止篩查？年齡>70歲，在10年內(nèi)已有3次以19篩查的時(shí)間間隔傳統(tǒng)細(xì)胞涂片檢查 每年一次TCT 每2年一次30歲以后，連續(xù)3次正常者，每2-3年一次FDA批準(zhǔn)HPVDNA檢測(cè)用于30歲以上的婦女聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查

同時(shí)使用

細(xì)胞學(xué)和HPVDNA檢測(cè)同時(shí)為陰性，篩查間隔可以3年一次注意對(duì)HPV感染的評(píng)估PracticeGuidelinesinOncology,2019,NCCN篩查的時(shí)間間隔傳統(tǒng)細(xì)胞涂片檢查 20HPV檢測(cè)應(yīng)用于宮頸癌篩查HPV病毒的發(fā)現(xiàn)—明確高危型HPV病毒持續(xù)感染為宮頸癌治病因高危型HPV感染通常為一過(guò)性感染并可自行清除但如自身免疫力較差，則會(huì)造成持續(xù)感染不同地區(qū)人群的宮頸癌患者中感染的HPV型別不同不同HPV型別致病類型及強(qiáng)弱不同HPV檢測(cè)應(yīng)用于宮頸癌篩查HPV病毒的發(fā)21HPV檢測(cè)的臨床應(yīng)用細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC的病例管理宮頸病變手術(shù)的術(shù)后隨訪與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合，應(yīng)用于30歲以上女性的宮頸癌篩查指導(dǎo)HPV疫苗的使用（兩種疫苗：4價(jià)、2價(jià)疫苗針對(duì)16/18）現(xiàn)有的HPV疫苗只能對(duì)HPV16、18、6、11型這四種型別的

感染進(jìn)行預(yù)防，且都以國(guó)外的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行研發(fā)對(duì)于中國(guó)女性的HPV感染型別的研究，有助于研發(fā)適合于

中國(guó)女性的HPV疫苗HPV檢測(cè)的臨床應(yīng)用細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC的病例管22美國(guó)ASCCP2019年版HPV（+）及細(xì)胞學(xué)正常HPV16/18(+)其他高危型陽(yáng)性陰道鏡重復(fù)細(xì)胞學(xué)和HPV檢測(cè)（間隔12個(gè)月）兩者均陰性細(xì)胞學(xué)陰性HPV（+）陰道鏡細(xì)胞學(xué)異常HPV（±）參照ASCCP指南常規(guī)篩查（3年后）美國(guó)ASCCP2019年版HPV（+）及細(xì)胞學(xué)正常HP23美國(guó)ASCCP：

≥30歲婦女的宮頸篩查中聯(lián)合篩查更為重要HPV(-)TCT(-)HPV(+)1年重復(fù)TCT和HPV檢查都為(-)TCT(-)HPV(+)TCT(+)不管HPV是否正常3年常規(guī)篩查陰道鏡3年常規(guī)篩查TCT結(jié)果為ASCUS及其以上病變按ASCCP指南處理美國(guó)ASCCP：

≥30歲婦女的宮頸篩查中聯(lián)合篩查更為重要24TCT與HPV檢測(cè)的聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌篩查TCT與HPV檢測(cè)聯(lián)合使用幾乎可以100%防止漏診，同時(shí)也可監(jiān)測(cè)HPV感染的轉(zhuǎn)歸現(xiàn)有HPV疫苗僅針對(duì)四種型別HPV病毒的感染，更多的HPV型別感染仍需通過(guò)定期的聯(lián)合篩查來(lái)防治臨床處理仍需遵循TBS診斷結(jié)果和三階梯診治流程TCT聯(lián)合HPV檢測(cè)有助于宮頸病變的個(gè)體化處理TCT與HPV檢測(cè)的聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌篩查TCT與HPV檢測(cè)25

美國(guó)ACOG

2009年版2009年11月20日,美國(guó)婦產(chǎn)科大學(xué)（ACOG）發(fā)表關(guān)于宮頸癌篩查的最新指南意見(jiàn)對(duì)于30歲以上的婦女，最佳的篩查方式是同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)篩查（TCT）和宮頸HPVDNA檢測(cè)如果兩項(xiàng)結(jié)果都正常，屬于宮頸癌的低危人群，篩查的間隔最好在三年以上

美國(guó)ACOG2009年版2009年1126HPV分型檢測(cè)分型才能區(qū)分持續(xù)或反復(fù)感染分型才能區(qū)分單一和多重感染后者危險(xiǎn)更大不同型別不同的患病風(fēng)險(xiǎn)致病性差異不同型別不同的處理方案相同細(xì)胞及組織學(xué)類型HPV陽(yáng)性與陰性要區(qū)別對(duì)待不同HPV感染型別要區(qū)別對(duì)待根據(jù)ASCCP指南，細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性，HPV16、18陽(yáng)性可選擇陰道鏡檢不同型別不同的致病類不同型別轉(zhuǎn)歸和愈后不同Pap陰性HPV陽(yáng)性HPV陰性三年內(nèi)復(fù)檢雙相檢查16/18基因分型陽(yáng)性陰性陰道鏡檢查一年內(nèi)復(fù)檢雙相檢查*美國(guó)ASCCP2019版HPV分型檢測(cè)分型才能區(qū)分持續(xù)或反復(fù)感染Pap陰性H27HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（1）------篩查

WHO建議HPV-DNA檢測(cè)不能用于30歲以下的女性。

HPVDNA檢測(cè)雖然對(duì)HPV很敏感，但是并不能預(yù)測(cè)它的病程和發(fā)展，要預(yù)測(cè)高危HPV是否

可致癌，需要作基因分型測(cè)試

雖然復(fù)查顯示同型HPV陽(yáng)性，但不能預(yù)

料這個(gè)女性的宮頸疾病病程?！獌H增

加了危險(xiǎn)性HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（1）------篩查2823890(篩查人數(shù))細(xì)胞學(xué)(-)HPV(-)21409細(xì)胞學(xué)(+)HPV(-)488細(xì)胞學(xué)(-)HPV(+)370細(xì)胞學(xué)(+)HPV(+)523陰道鏡檢查533無(wú)病例發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)3例發(fā)現(xiàn)59例發(fā)現(xiàn)114例HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（1）------篩查23890(篩查人數(shù))細(xì)胞學(xué)(-)細(xì)胞學(xué)(+)細(xì)胞學(xué)(-)29北美和歐洲的篩查研究顯示，在≥35歲的女性人群中，HPV試驗(yàn)檢測(cè)≥CIN2病變的敏感性和特異性分別為95%和93%。細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)≥ASCUS的敏感性和特異性分別為60%和97%聯(lián)合使用HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性比單獨(dú)使用任何一種都顯著提高，陰性預(yù)

測(cè)值達(dá)99%-100%HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（1）------篩查北美和歐洲的篩查研究顯示，在≥35歲的HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（130HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（2）------陰道鏡適應(yīng)征

≧30婦女，細(xì)胞學(xué)未見(jiàn)上皮內(nèi)病變和惡性細(xì)胞，HPV16，18建議陰道鏡。

2019consensusguidelinesformanagementofwomenwithabnormalcervicalcancerscreeningtestsAJOG.ORGPap陰性HPV陽(yáng)性HPV陰性三年內(nèi)復(fù)檢雙相檢查16/18基因分型陽(yáng)性陰性陰道鏡檢查一年內(nèi)復(fù)檢雙相檢查HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（2）------陰道鏡適應(yīng)征31波特蘭的一項(xiàng)研究表明，≥30歲細(xì)胞學(xué)陰性的女性中，HPV16或18陽(yáng)性的女性在10年隨訪中出現(xiàn)CIN3的比率分別為21%和18%。與此相比，

其他高危型HPV陽(yáng)性的女性中，CIN3的風(fēng)

險(xiǎn)性僅1.5%。

HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（2）——陰道鏡適應(yīng)征波特蘭的一項(xiàng)研究表明，≥30歲細(xì)胞學(xué)陰性的女32Plummeretal10058例宮頸癌，8550宮頸鱗癌，1508宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌HPV16感染與宮頸癌的相關(guān)具有普遍意義

宮頸鱗癌：HPV16占46-63%；

HPV18占10-14%

宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌：HPV18占37-

41%；

HPV16占26-36%。HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（2）——陰道鏡適應(yīng)征PlummeretalHPV分型檢測(cè)應(yīng)用（2）33CIN2\3HR-HPV:94.0%常見(jiàn)亞型：HPV16、33、58、31和52型LogisticRegression分析：HPV16、33和31與CIN2\3相關(guān)，是主要致病型

——國(guó)家十五科研攻關(guān)項(xiàng)目

HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（2）

——陰道鏡適應(yīng)征CIN2\3HR-HPV:94.0%34四種HPV亞型在≥30歲婦女宮頸癌篩查中的作用

四種HPV亞型在≥30歲婦女宮頸癌篩查中的作用

35HPV16亞型在≥30歲婦女宮頸癌篩查中的作用

HPV16亞型在≥30歲婦女宮頸癌篩查中的作用

36

2009年（ASCCP）最新HPV檢測(cè)指南HPV陽(yáng)性及細(xì)胞學(xué)正常HPV16/18(+)其他高危型陽(yáng)性陰道鏡重復(fù)細(xì)胞學(xué)和HPV檢測(cè)（間隔12個(gè)月）兩者均陰性細(xì)胞學(xué)陰性HPV（+）陰道鏡細(xì)胞學(xué)異常HPV（±）參照ASCCP指南常規(guī)篩查（3年后）

2009年（ASCCP）最新HPV檢測(cè)指南HPV陽(yáng)性及細(xì)37HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（3）------ASCUS分層ASC病例的管理(2019ASCCP)大于20歲人群6個(gè)月后重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查高危型HPV檢測(cè)（可以用殘留的液基做）陰道鏡檢查（40-60%）

2019consensusguidelinesformanagementofwomenwith

abnormalcervicalcancerscreeningtestsAJOG.ORGHPV分型檢測(cè)應(yīng)用（3）------ASCUS分層ASC病例38HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（3）------ASCUS分層

316例ASCUS患者中,CINⅡ級(jí)以上的陽(yáng)性檢出率為18.99%（60／316）,宮頸細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS中,HR-HPV陽(yáng)性率為

68.99%（218／316），

ASCUS組中HR-HPV陽(yáng)性患者CINⅡ級(jí)以上

宮頸病變的檢出率高于HPV陰性者，差

異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（3）------ASCUS分層316例39HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（4）------絕經(jīng)期婦女LSIL2019consensusguidelinesformanagementofwomenwith

abnormalcervicalcancerscreeningtestsAJOG.ORG“reflex”HPV檢測(cè)6和12個(gè)月時(shí)細(xì)胞學(xué)陰道鏡HPV陰性或陰道鏡未發(fā)現(xiàn)CIN12個(gè)月時(shí)細(xì)胞學(xué)是推薦的HPV陽(yáng)性或細(xì)胞學(xué)≥ASC-US陰道鏡是推薦的HPV陰性或連續(xù)2次細(xì)胞學(xué)“陰性”常規(guī)細(xì)胞學(xué)篩查是推薦的HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（4）------絕經(jīng)期婦女LSIL40

消融或切除治療CIN失敗的比率在1%~25%之間。系統(tǒng)性的綜述表明，不同方法的整體失敗率為5%~15%，不同方法間無(wú)顯著差異。大多數(shù)失敗發(fā)生在治療2年后。

一個(gè)系統(tǒng)性綜述報(bào)道，在治療后20年內(nèi)女性浸潤(rùn)癌的罹患率約10萬(wàn)分之56，高于美國(guó)普通人群（5.6每10萬(wàn)人年）。HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（5）------宮頸病變的隨訪消融或切除治療CIN失敗的比率在1%~25%之間。系統(tǒng)41治療后隨訪中應(yīng)用HPVDNA檢測(cè)的系統(tǒng)性綜述表明，其性能優(yōu)于細(xì)胞學(xué)隨訪方法。治療后6個(gè)月HPV檢測(cè)鑒別復(fù)發(fā)/持續(xù)性CIN的敏感

性達(dá)90%，而且保持這種水平到24個(gè)月。與

此相比，細(xì)胞學(xué)的敏感性大約為70%。

一些研究（不是所有研究）中，聯(lián)合使

用HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)可以增加敏感性。HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（5）------宮頸病變的隨訪治療后隨訪中應(yīng)用HPVDNA檢測(cè)的系統(tǒng)性綜述HPV分型檢測(cè)42對(duì)細(xì)胞學(xué)ASC-US、ASC-H或LSIL的CIN1推薦的管理方案是，12個(gè)月時(shí)HPVDNA檢測(cè)或6個(gè)月、12個(gè)月時(shí)重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)對(duì)CIN2、3女性治療后的管理方法包括6-12個(gè)月時(shí)進(jìn)

行HPVDNA檢測(cè)、單獨(dú)6個(gè)月采用細(xì)胞學(xué)或聯(lián)合使用

細(xì)胞學(xué)和陰道鏡HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（5）------宮頸病變的隨訪對(duì)細(xì)胞學(xué)ASC-US、ASC-H或LSIL的CIN143AIS的管理方案

6個(gè)月時(shí)聯(lián)合使用細(xì)胞學(xué)

HPV檢測(cè)宮頸管采樣陰道鏡HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（5）------宮頸病變的隨訪AIS的管理方案HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（44HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（6）------指導(dǎo)疫苗的使用疫苗是模擬HPV16/18的L1蛋白衣殼（一種病毒樣顆粒-病毒脂蛋白）給HPV陰性的女性接種這兩種疫苗后，有90%以上的人不會(huì)產(chǎn)生由HPV16/18型引起的癌前病變

到目前為止，這種高濃度，長(zhǎng)效抗HPV持續(xù)感染的預(yù)

防疫苗才開(kāi)展了六年如果接受預(yù)防者在接種時(shí)已經(jīng)HPV16/18陽(yáng)性，

是否有治療作用尚未明了HPV分型檢測(cè)應(yīng)用（6）------指導(dǎo)疫苗的使用疫苗是模擬45下生殖道HPV感染的干預(yù)治療

HPV的感染是非系統(tǒng)性感染，只局限于最初的感染的部位，感染部位的局部細(xì)胞因子和非特異性的效應(yīng)細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞是阻止感染的第一道防線。

宣講相關(guān)知識(shí)，調(diào)動(dòng)患者免疫功能增強(qiáng)生殖道局部免疫力，可加速對(duì)HPV的清除

用避孕套控制HPV在性伴間傳播是有效和必要的

下生殖道HPV感染的干預(yù)治療HPV的感染是非系統(tǒng)性感染，46

HPV是人類癌瘤發(fā)病中唯一可以完全確認(rèn)的致癌病毒?，F(xiàn)今的研究甚至可以證實(shí)：預(yù)防HPV感染就可以預(yù)防宮頸癌，

沒(méi)有HPV感染就可以不罹患宮頸癌。HPV是人類癌瘤發(fā)病中唯一可以完全確認(rèn)的致癌病47HPVDNA檢測(cè)常用技術(shù)HPVDNA檢測(cè)常用技術(shù)48

HPVDNA檢測(cè)技術(shù)

常用方法：

其他方法：普通PCR，原位雜交，SPR，

DNA測(cè)序等

基因芯片技術(shù)

二代雜交捕獲

熒光定量PCR

HPVDNA檢測(cè)技術(shù)常用方法：49(一)基因芯片技術(shù)玻璃芯片膜芯片流式熒光雜交法（液態(tài)芯片）固相芯片(一)基因芯片技術(shù)玻璃芯片固相芯片50玻璃芯片與膜芯片（固相芯片）玻璃芯片

應(yīng)用領(lǐng)域：

主要用于科研領(lǐng)域，如基因表達(dá)譜分析、基因多態(tài)性分析、大

規(guī)模序列分析、藥物篩選、基因診斷的研究等

目前僅極少數(shù)用于臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域

局限：制作工藝相對(duì)復(fù)雜

信號(hào)檢測(cè)需專門的儀器設(shè)備（激光掃描儀）

閱讀設(shè)備的成本局限（費(fèi)用高昂）玻璃芯片與膜芯片（固相芯片）玻璃芯片51

應(yīng)用領(lǐng)域：高密度芯片目前仍主要用于科研領(lǐng)域

低密度芯片已經(jīng)用于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域低密度芯片的特點(diǎn)：

工藝相對(duì)簡(jiǎn)便

信號(hào)檢測(cè)簡(jiǎn)便

投入費(fèi)用較低

現(xiàn)狀：目前臨床檢測(cè)中，往往還不需要使用到大規(guī)模探針陣列，

從實(shí)用性、使用成本、方便性等角度考慮，低密度芯片

（十幾個(gè)至幾十個(gè)探針）更易于被接受膜芯片膜芯片52亞能HPV基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)PCR擴(kuò)增結(jié)合DNA反向點(diǎn)雜交技術(shù)靈敏度更高實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及操作流程應(yīng)當(dāng)符和規(guī)范PCR的檢測(cè)結(jié)果是可靠的檢測(cè)通量大，可同時(shí)檢測(cè)15種HPV亞型，包括13種高危型探針設(shè)計(jì)，特異性強(qiáng)膜條顯示檢測(cè)結(jié)果，讀取更方便采用dUTP-UNG防污染體系，有效避免假陽(yáng)性結(jié)果檢測(cè)數(shù)量隨需而變，單人份、多人份檢測(cè)任選有力的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明WHO國(guó)際癌癥研究所在中國(guó)的研究項(xiàng)目顯示，亞能對(duì)于高度病變

的檢測(cè)靈敏度達(dá)100%、陰性預(yù)測(cè)值達(dá)99.7%，特異性、準(zhǔn)確性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和都很高。對(duì)約3000人份的臨床數(shù)據(jù)顯示，普通人群的HPV高危型感染率

為11%左右，醫(yī)院高危人群的HPV高危型感染率為20%左右，這

與文獻(xiàn)報(bào)道相當(dāng)。亞能HPV基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)PCR擴(kuò)增結(jié)合DNA反向點(diǎn)雜交技53亞能HPV基因分型技術(shù)原理（PCR-反向點(diǎn)雜交法）一次雜交反應(yīng)可以檢測(cè)多種靶序列亞能HPV基因分型技術(shù)原理（PCR-反向點(diǎn)雜交法）一次雜交54PCR技術(shù)KaryB.Mullis（穆利斯）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：

利用DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)原則及半保留復(fù)制的特性，

將目的DNA在體外進(jìn)行大量復(fù)制美國(guó)PECetus公司的KaryMullis于1983年創(chuàng)建1989年美國(guó)《Science》雜志將PCR列為

十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)PolymeraseChainReaction

PCR技術(shù)KaryB.Mullis（穆利斯）聚合酶鏈55PCR技術(shù)原理

高溫變性低溫退火中溫延伸PCR三步曲：PCR產(chǎn)物的生成量

以指數(shù)方式增加PCR技術(shù)原理高溫變性PCR三步曲：PCR產(chǎn)物的生56PCR技術(shù)特點(diǎn)-高度的靈敏性PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的35輪循環(huán)，擴(kuò)增量理論上達(dá)235個(gè)拷貝（680億?。㏄CR技術(shù)特點(diǎn)-高度的靈敏性PCR產(chǎn)物的57核酸分子雜交核酸分子雜交是指具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。分子雜交具有高度的特異性。

探針雜交體核酸分子雜交核酸分子雜交是指具有一定同源性的兩條探針雜交體58亞能HPV基因分型檢測(cè)流程亞能HPV基因分型檢測(cè)流程59結(jié)果判讀HPV16HPV6,52陰性樣本單一感染多重感染結(jié)果判讀HPV16HPV6,52陰性樣本單一感染多重感染60亞能HPV產(chǎn)品賣點(diǎn)詳見(jiàn)F:\英碩力\（三）亞能HPV產(chǎn)品賣點(diǎn).ppt亞能HPV產(chǎn)品賣點(diǎn)詳見(jiàn)F:\英碩力\（三）亞能HPV產(chǎn)品賣點(diǎn)61HPV檢測(cè)耗材列表及示意圖

詳見(jiàn)F:\英碩力\HPV基因分型檢測(cè)常用耗材圖示.docHPV檢測(cè)耗材列表及示意圖

詳見(jiàn)F:\英碩力\HPV基因分62實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備清單詳見(jiàn)F:\英碩力\實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備清單-20191227.xls實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備清單詳見(jiàn)F:\英碩力\實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備清單-2063HPV主要競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品介紹HPV主要競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品介紹64PCR-反向點(diǎn)雜交法特點(diǎn)

高靈敏度-PCR

高特異性-核酸分子雜交

高通量-膜上固定多種探針

安全無(wú)毒-生物素標(biāo)記PCR-反向點(diǎn)雜交法特點(diǎn)高靈敏度-PCR65流式熒光雜交法-液態(tài)芯片首先PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品，得到的PCR產(chǎn)物和微球上交聯(lián)的探針雜交，加入熒光標(biāo)記反應(yīng)，最后在流式熒光檢測(cè)儀上檢測(cè)熒光信號(hào)。如果PCR產(chǎn)物和探針配對(duì)，則微球上相應(yīng)探針捕獲到標(biāo)有Biotin的PCR產(chǎn)物，加入熒光標(biāo)記StrepAvidin-PE后，形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-Biotin-StrepAvidin-PE復(fù)合物。在檢測(cè)儀上即可檢測(cè)到對(duì)應(yīng)微球的熒光信號(hào)。如果PCR產(chǎn)物與探針不配對(duì)，

則對(duì)應(yīng)微球的熒光信號(hào)為背景

信號(hào)。流式熒光雜交法-液態(tài)芯片首先PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品，得到的66流式熒光雜交法操作流程PCR擴(kuò)增DNA提取編碼微球與探針混合向檢測(cè)板中加入微球-探針雜交液，加入PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物變性雜交，48℃，30min加入鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白，15minLuminex100多功能流式分析儀檢測(cè)流式熒光雜交法操作流程PCR擴(kuò)增D67代表廠家：上海透景人乳頭瘤病毒核酸分型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的基因型：19種高危型：

16,18,31,33,35,39,45,51,52,

56,58,59,

68,73,83，26,55,

61,66７種低危型：

6,11,40,42,44,53,54認(rèn)證：國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2009第3400020號(hào)進(jìn)口專用儀器(美國(guó)Luminex多功能流式點(diǎn)陣分析儀）流式熒光雜交法HPV61型為低危型！參照：NEnglJMed2019;348:518-27代表廠家：上海透景流式熒光雜交法HPV61型為低危型！參68Luminex100TM多功能流式點(diǎn)陣儀Luminex100TM多功能流式點(diǎn)陣儀69hpv培訓(xùn)課件70hpv培訓(xùn)課件71流式熒光雜交法-不定量流式熒光雜交法-不定量72流式熒光雜交法總結(jié)結(jié)合普通PCR技術(shù)，核酸分子雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)尚不成熟，靈敏度和特異性有待提高無(wú)洗滌步驟，無(wú)法去除非特異性雜交，且有背景熒光信號(hào)干擾技術(shù)難點(diǎn)為探針與微球的交聯(lián)，產(chǎn)品性能上存在不穩(wěn)定性只分型，不定量需價(jià)格昂貴的流式熒光檢測(cè)儀流式熒光雜交法總結(jié)73

（二）二代雜交捕獲

——HybridCapture2,HC2基本原理：利用對(duì)抗體捕獲信號(hào)的放大

和化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)檢測(cè)通量：13種高危HPV基因型,

不能提示具體的基因型（二）二代雜交捕獲

——H74計(jì)算機(jī)判讀15min雜交60min抗體捕獲60min第二抗體結(jié)合，化學(xué)發(fā)光30minDNA變性45minHC2實(shí)驗(yàn)步驟圖示計(jì)算機(jī)雜交抗體第二抗體結(jié)合，DNAHC2實(shí)驗(yàn)步驟圖示75吸取變性劑于對(duì)照和樣本管中旋渦振蕩10秒65℃孵育45分鐘，采用MicroplateheaterIHC2操作步驟-DNA變性吸取變性劑于對(duì)照和樣本管中旋渦振蕩10秒65℃孵育45分鐘，76將已變性的樣本混勻，吸取75ul于“雜交微孔板”中20-25℃孵育10分鐘加入25ul高危HPV探針于微孔板中65℃孵育60分鐘置于RotaryShakerI中，1100rpm，3±2分鐘準(zhǔn)備HPV探針混合物HC2操作步驟-雜交將已變性的樣本混勻，吸取75ul于“雜交微孔板”中20-77將雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至“捕獲微孔板”相應(yīng)的小孔中20-25℃孵育30-45分鐘20-25℃孵育60分鐘，1100rpm加入75ulDetectionReagent1（堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗體）于“捕獲”微孔板相應(yīng)的小孔中HC2操作步驟-抗體捕獲及酶標(biāo)將雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至“捕獲微孔板”相應(yīng)的小孔中20-25℃孵育378洗滌微孔板：采用AutomatedPlateWasherI或進(jìn)行手動(dòng)洗板，重復(fù)洗6次加入75ulDetectionReagent2（化學(xué)顯色底物）于“捕獲”微孔板相應(yīng)的小孔中20-25℃孵育15-30分鐘采用Digenemicroplateluminometer(DML2000)讀數(shù)HC2操作步驟-洗板及化學(xué)顯色洗滌微孔板：采用AutomatedPlateWasher79HC2如何進(jìn)行結(jié)果判讀?1、陰性對(duì)照每次實(shí)驗(yàn)必須同時(shí)做3份陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的結(jié)果必須為10-250RLU（相對(duì)光單位）。變異系數(shù)（%CV）應(yīng)該≤25%，如果＞25%，那么去掉偏離平均值最遠(yuǎn)的一個(gè)陰性對(duì)照，用剩下的兩個(gè)陰性對(duì)照計(jì)算平均值以及變異系數(shù)。%CV必須≤25%，否則，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，必須重做，無(wú)法給病人出報(bào)告HC2如何進(jìn)行結(jié)果判讀?1、陰性對(duì)照802.標(biāo)準(zhǔn)品每次實(shí)驗(yàn)必須同時(shí)做3份高危HPV標(biāo)準(zhǔn)品。%CV應(yīng)該≤15%，如果＞15%，那么去掉偏離平均值最遠(yuǎn)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，用剩下的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算平均值以及變異系數(shù)。%CV必須≤15%，否則，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，必須重做，無(wú)法給病人出報(bào)告3.用標(biāo)準(zhǔn)品平均值（MHRC）以及陰性對(duì)照平均值MNC計(jì)算MHRC/MNC比值.2.0≤MHRC/MNC≤15。如果＜2.0或＞15，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，必須重做。4.如果符合以上的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果是可靠的。此時(shí)的Cutoff值（陽(yáng)性標(biāo)本評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)）就是MHRC2.標(biāo)準(zhǔn)品81陰性對(duì)照（NC）高危HPV標(biāo)準(zhǔn)品(HRC)9731210133591307平均值96318%CV4.94.7HRC/NC3.31Cutoff值=318，所有標(biāo)本的相對(duì)光單位（RLU）應(yīng)該轉(zhuǎn)換為與Cutoff值的比值，比值大于1為陽(yáng)性，比值小于1則為陰性陽(yáng)性結(jié)果的判定陰性對(duì)照（NC）高危HPV標(biāo)準(zhǔn)品(HRC)9731210182質(zhì)控對(duì)照HPV基因型預(yù)期的結(jié)果（RLU/Cutoff值）最小值最大值QC1-LRHPV60.0010.999QC2-HRHPV1628質(zhì)控對(duì)照HPV基因型預(yù)期的結(jié)果（RLU83HC2技術(shù)總結(jié)技術(shù)上，采用核酸分子雜交，抗體捕獲（吸附雜交體），化學(xué)顯色不分型不能檢測(cè)HPV多重感染不定量有交叉雜交反應(yīng)每次需要消耗8個(gè)參考品，試劑成本高手動(dòng)操作很多，步驟繁瑣需價(jià)格昂貴的基因雜交信號(hào)放大系統(tǒng)HC2技術(shù)總結(jié)技術(shù)上，采用核酸分子雜交，抗體捕獲（吸附雜交體84(三)熒光定量PCR技術(shù)原理：

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累,實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR過(guò)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板量進(jìn)行定量分析.定量，不分型(三)熒光定量PCR技術(shù)原理：85熒光基團(tuán)的分類化學(xué)原理熒光基團(tuán)的分類化學(xué)原理86熒光定量PCR-基于Taqman探針化學(xué)原理熒光定量PCR-基于Taqman探針化學(xué)原理87熒光定量PCR技術(shù)總結(jié)能定量檢測(cè)HPV拷貝數(shù)靈敏度高不分型不能檢測(cè)HPV多重感染檢測(cè)通量有限，目前最多檢測(cè)13種高危型需價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀熒光定量PCR技術(shù)總結(jié)能定量檢測(cè)HPV拷貝數(shù)88（四）原位雜交采用熒光、生物素、地高辛等標(biāo)記的探針，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，與組織切片、細(xì)胞涂片等標(biāo)本中的靶序列特異雜交，經(jīng)信號(hào)放大及顯色后，顯微鏡下觀察結(jié)果（四）原位雜交采用熒光、生物素、地高辛等標(biāo)記的89原位雜交試劑盒代表廠家：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司原位雜交試劑盒代表廠家：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司90原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟以地高辛標(biāo)記HPVDNA探針為例

4-6mm切片，用處理過(guò)的玻片撈片。

56-60℃烤片，2-16小時(shí)。新鮮二甲苯脫蠟，10分鐘×2次。

100%乙醇5分鐘×2次，空氣干燥。加入50ml胃酶工作液，37℃消化30分鐘。棄去胃酶工作液，逐級(jí)酒精脫水1分鐘×3次，空氣干燥。加10-20ml探針，加蓋玻片。用橡膠水泥將蓋片周圍密封（目錄編號(hào)ZLI-9601）。變性95℃5-7分鐘。雜交37℃2-16小時(shí)。揭去橡膠水泥，將切片插入PBS/TBS緩沖液中以便去掉蓋玻片，約5-10分鐘。每張切片加入2-3滴雜交后洗液，37℃孵育15分鐘。

PBS/TBS緩沖液洗，1分鐘×3次。每張切片加入適量辣根酶標(biāo)記抗地高辛抗體，37℃孵育30分鐘。

PBS/TBS緩沖液洗，1分鐘×3次。滴加適量DAB工作液，鏡下觀察顯色結(jié)果，約3-10分鐘。棄去顯色液，蒸餾水或自來(lái)水沖洗。選擇：每張切片加入1滴復(fù)染劑，5-10秒鐘。蒸餾水或自來(lái)水沖洗。·脫水、透明、封片。原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟以地高辛標(biāo)記HPVDNA探針為例91原位雜交技術(shù)總結(jié)靈敏度低（無(wú)PCR擴(kuò)增）特異性高檢測(cè)通量低不能分型不能定量操作步驟繁瑣非常費(fèi)時(shí)，需要兩天HPV檢測(cè)產(chǎn)品無(wú)注冊(cè)證，僅僅用于科研原位雜交技術(shù)總結(jié)靈敏度低（無(wú)PCR擴(kuò)增）92

（五）表面等離子體諧振

——（SPR）技術(shù)93（五）表面等離子體諧振

93表面等離子諧振現(xiàn)象SurfacePlasmonResonance，SPR入射光(單波長(zhǎng)偏振光)在玻片-金膜界面全反射，激發(fā)金膜中的自由電子產(chǎn)生表面等離子體。當(dāng)光波激發(fā)頻率與表面等離子體的振動(dòng)頻率相等時(shí)，二者發(fā)生諧振，光能被吸收,反射光幾乎完全消失,此時(shí)入射光的角度被稱作SPR角（諧振角）。

表面等離子諧振現(xiàn)象SurfacePlasmonReson94分析SPR曲線諧振角變化芯片表面質(zhì)量改變(折射率變化)分子相互作用分析SPR曲線諧振角變化芯片表面質(zhì)量改變(折射率變化)分子相95

SPR檢測(cè)核酸原理示意圖反應(yīng)曲線Time(s)SPR角(m°)SSSS傳感芯片寡核苷酸探針PCR產(chǎn)物變性dsDNAssDNA雜交SPR檢測(cè)核酸原理示意圖反應(yīng)曲線Time(s)SPR961）核酸提取試劑2）PCR反應(yīng)試劑3）SPR檢測(cè)試劑和芯片

北京金菩嘉-HPV分型檢測(cè)試劑盒組成1）核酸提取試劑北京金菩嘉-HPV分型檢測(cè)試劑盒組成97HPV基因檢測(cè)芯片，共26個(gè)通道，一個(gè)陰性，一個(gè)IC，24個(gè)hpv探針通道14151617181920212223242526類型51816835611427044435440陰性通道2~17：高危HPV;通道18~25：低危HPVSPR檢測(cè)芯片探針點(diǎn)陣通道12345678910111213類型IC161831335258565966455339SPRHPV檢測(cè)芯片HPV基因檢測(cè)芯片，共26個(gè)通道，一個(gè)陰性，一個(gè)IC，24個(gè)98

SPR技術(shù)檢測(cè)H

PV流程圖樣品制備DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物線上檢測(cè)輸出報(bào)告成品芯片包被分型探針固定包被芯片芯片基片SPR技術(shù)檢測(cè)H

PV流程圖樣品制備DNAPC99SPR設(shè)備簡(jiǎn)介W2600型生物傳感芯片閱讀儀SPR設(shè)備簡(jiǎn)介W2600型生物傳感芯片閱讀儀100W2600工作流程開(kāi)始檢測(cè)后系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行以下動(dòng)作：清空機(jī)器內(nèi)部樣品匣更換樣品匣更換芯片匣清洗采樣針、buffer針掃描芯片注入系統(tǒng)buffer注入系統(tǒng)buffer掃描芯片采樣等待30min（雜交）掃描芯片輸出檢測(cè)結(jié)果W2600工作流程開(kāi)始檢測(cè)后系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行以下動(dòng)作：清空機(jī)器內(nèi)101SPR技術(shù)檢測(cè)HPV總結(jié)同樣需要DNA提取采用普通PCR擴(kuò)增，核酸分子雜交采用SPR技術(shù)（物理手段）檢測(cè)雜交信號(hào)無(wú)臨床應(yīng)用文獻(xiàn)無(wú)注冊(cè)證SPR技術(shù)檢測(cè)HPV總結(jié)同樣需要DNA提取102（六）HPVDNA序列測(cè)定

經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam&Gilbert,1977)（六）HPVDNA序列測(cè)定經(jīng)典方法:103與PCR反應(yīng)類似反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測(cè)序引物反應(yīng)過(guò)程：變性－復(fù)性－延伸－終止Sanger雙脫氧鏈終止法與PCR反應(yīng)類似Sanger雙脫氧鏈終止法104Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)

終止劑可以當(dāng)作正常堿

基參與復(fù)制，一旦摻入DNA中，

其后延伸反應(yīng)就

不能繼續(xù)。Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）105*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較106雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理反應(yīng)體系中含有ddNTPs,因此，在復(fù)制的延伸過(guò)程中，在DNA任何堿基位置都可能出現(xiàn)終止反應(yīng)，從而形成不同長(zhǎng)度的寡核苷酸混合物。所以，每條寡核苷酸都有固定的起點(diǎn)，但有不同的終點(diǎn)，長(zhǎng)度由ddNTPs摻入的位置決定。雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理反應(yīng)體系中含有ddNTPs,因此，在107在高分辨率的電泳條件下（如毛細(xì)管電泳），

能夠?qū)㈤L(zhǎng)度相差一個(gè)堿基的寡核苷酸分離開(kāi)。ddNTPs包含4中雙脫氧核苷酸，分別帶有不同的熒光標(biāo)記，當(dāng)帶有不同熒光標(biāo)記的寡核苷酸依據(jù)長(zhǎng)度大小先后通過(guò)熒光檢測(cè)儀時(shí)，檢測(cè)儀可以自動(dòng)讀取DNA上的核苷酸順序在高分辨率的電泳條件下（如毛細(xì)管電泳），108凝膠電泳DNA在電泳中的遷移率與其片段長(zhǎng)度有關(guān)，片段小的跑得快，片段大的跑得慢，因而彼此分離開(kāi)。凝膠電泳DNA在電泳中109雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理示意圖雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理示意圖110DNA全自動(dòng)分析儀ABI3100遺傳分析儀

3700型全自動(dòng)遺傳分析儀安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)377型遺傳分析儀DNA全自動(dòng)分析儀ABI3100遺傳分析儀

3700型111DNA提取PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物純化（電泳或?qū)Ｓ迷噭┖校┳x取序列及分析測(cè)序儀檢測(cè)產(chǎn)物純化測(cè)序反應(yīng)HPVDNA測(cè)序流程DNA提取PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物純化（電泳或?qū)Ｓ迷噭┖校┳x取序112測(cè)序法檢測(cè)HPV的局限性首先必須對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于事先不知道是哪一種HPV基因型的感染，所以必須采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增單一感染（如HPV16）多重感染（如HPV16，18，52，58）鑒定無(wú)法鑒定基因型！測(cè)序法檢測(cè)HPV的局限性首先必須對(duì)待測(cè)樣單一感染多重感染鑒定113DNA測(cè)序技術(shù)總結(jié)測(cè)序之前必須做對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增或DNA克隆測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴于引物的特異性難以對(duì)HPV多重感染進(jìn)行測(cè)序鑒定操作復(fù)雜，耗時(shí)測(cè)序儀價(jià)格昂貴國(guó)內(nèi)開(kāi)展基因測(cè)序的機(jī)構(gòu)或企業(yè)非常少無(wú)注冊(cè)證，僅僅用于科研DNA測(cè)序技術(shù)總結(jié)測(cè)序之前必須做對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行PCR114各種HPVDNA檢測(cè)技術(shù)總結(jié)膜芯片流式熒光雜交法雜交捕獲二代熒光定量PCR原位雜交SPR測(cè)序原理PCR+反向點(diǎn)雜交+化學(xué)顯色PCR+雜交+熒光標(biāo)記雜交+抗體捕獲+化學(xué)顯色PCR+熒光標(biāo)記雜交+化學(xué)顯色PCR+雜交+光學(xué)檢測(cè)PCR+雙脫氧鏈終止法探針固定方式固定于膜芯片上固定于微球上不固定無(wú)不固定金膜無(wú)能否分型分型分型不分型不分型不分型分型分型能否鑒定多重感染能能不能不能不能能難信號(hào)檢測(cè)手段化學(xué)顯色熒光掃描化學(xué)顯色熒光掃描化學(xué)顯色SPR角熒光掃描靈敏度高低低高低無(wú)文獻(xiàn)高特異度高低交叉反應(yīng)高高無(wú)文獻(xiàn)高檢測(cè)通量高高低低極低高低儀器設(shè)備要求低很高很高高低高很高有無(wú)注冊(cè)證有有有有無(wú)無(wú)無(wú)各種HPVDNA檢測(cè)技術(shù)總結(jié)膜芯片流式熒光雜交法雜交捕獲115基因芯片技術(shù)特點(diǎn)高靈敏度-PCR高特異性-核酸分子雜交高通量-膜上固定多種探針安全無(wú)毒-生物素標(biāo)記

基因芯片技術(shù)特點(diǎn)高靈敏度-PCR116

二、HPV主要競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品基因芯片技術(shù)代表廠家：亞能、凱普、達(dá)安二代雜交捕獲

代表廠家：Qiagen（凱杰）熒光定量PCR

代表廠家：港龍，達(dá)安，凱普，復(fù)星，

匹基流式熒光雜交法

代表廠家：上海透景二、HPV主要競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品基因芯片技術(shù)117

三、亞能HPV與競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品的對(duì)比1、亞能和凱普HPV基因分型產(chǎn)品對(duì)比2、亞能基因芯片技術(shù)與二代雜交捕獲對(duì)比3、亞能基因芯片技術(shù)與熒光定量PCR對(duì)比4、亞能基因芯片技術(shù)與流式熒光雜交法對(duì)比三、亞能HPV與競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品的對(duì)比1、亞能和凱普HPV基因分118

亞能

凱普技術(shù)原理PCR+反向點(diǎn)雜交PCR+導(dǎo)流雜交（實(shí)質(zhì)也是反向點(diǎn)雜交）經(jīng)典雜交方法導(dǎo)流雜交是通過(guò)外力抽吸加壓，人為縮短雜交時(shí)間雜交操作時(shí)間1份標(biāo)本70min15份75min25份80min48份90min96份100min樣本量越多，時(shí)間優(yōu)勢(shì)越明顯！1份標(biāo)本40min15份60min16~30份60min×231~45份60min×346~60份60min×461~75份60min×576~90份60min×696份60min×7基本設(shè)備離心機(jī)、PCR儀、普通雜交儀（價(jià)格低廉）離心機(jī)、PCR儀、專用雜交儀（價(jià)格較貴）樣本來(lái)源宮頸脫落細(xì)胞，疣體組織，病理石蠟切片，液基細(xì)胞學(xué)樣本宮頸脫落細(xì)胞、疣體組織（一）亞能和凱普HPV基因分型產(chǎn)品對(duì)比亞能凱普技119亞能凱普DNA提取提取試劑通過(guò)國(guó)家認(rèn)證提取試劑只含裂解液一種成分提取試劑盒未通過(guò)國(guó)家認(rèn)證提取試劑分溶液Ⅰ,Ⅱ,ⅢPCRPCR反應(yīng)液已分裝擴(kuò)增體系未分裝，人工配制反應(yīng)液雜交雜交前準(zhǔn)備工作簡(jiǎn)單常規(guī)雜交，常態(tài)性碰撞接觸，多次接觸，反應(yīng)充分雜交儀中空氣傳導(dǎo)加熱，溫度均勻、準(zhǔn)確，更高特異性獨(dú)立雜交管內(nèi)雜交，無(wú)交叉污染儀器運(yùn)轉(zhuǎn)中操作者可休息雜交前準(zhǔn)備工作復(fù)雜，要通過(guò)一系列步驟人工分隔反應(yīng)室導(dǎo)流雜交，人為外力作用，一過(guò)性接觸，反應(yīng)不充分雜交反應(yīng)室之間溫度有差異，特異性較差反應(yīng)室分隔不嚴(yán)，交叉污染儀器運(yùn)轉(zhuǎn)中操作者不可休息亞能凱普DNA提取試劑通過(guò)國(guó)家認(rèn)證提取試劑盒未通過(guò)國(guó)家認(rèn)證P120凱普導(dǎo)流雜交儀凱普導(dǎo)流雜交儀121亞能凱普洗膜洗膜充分，無(wú)雜交背景或淺背景洗膜不充分，且容易造成很深的雜交背景孵育在孵育前無(wú)封阻步驟排出封阻液過(guò)程緩慢，且封阻效果對(duì)顯色背景影響很大結(jié)果判讀顯色斑點(diǎn)大判讀結(jié)果受背景顏色影響小膜條小，顯色斑點(diǎn)小判讀結(jié)果受背景顏色影響大,易造成錯(cuò)誤判讀檢測(cè)通量23型無(wú)CP8304（81型），低危型21型無(wú)HPV73，83，MM4（82）而73、82型為IARC認(rèn)定的15種常見(jiàn)高危型之一亞能凱普洗膜洗膜充分，無(wú)雜交背景或淺背景洗膜不充分，且容易造122導(dǎo)流雜交法雜交效率和靈敏度膜條目的DNA基因型特異性探針固定在膜條的特定位置探針只占據(jù)膜條面積的極小部分目的DNA在膜條上均勻分布，定向流動(dòng)，一過(guò)性接觸！雜交上的DNA只占目的DNA的極小部分雜交效率低，靈敏度低！！導(dǎo)流雜交法雜交效率和靈敏度膜條目的DNA基因型特異性探針固定123亞能和凱普膜條顯色對(duì)比亞能凱普膜條尺寸：12mm×78mm膜條尺寸：22mm×22mm亞能和凱普膜條顯色對(duì)比亞能凱普膜條尺寸：12mm×78mm膜124亞能產(chǎn)品與凱普的比較優(yōu)勢(shì)使用普通雜交儀可檢測(cè)更多來(lái)源的標(biāo)本樣本越多，時(shí)間優(yōu)勢(shì)越明顯檢測(cè)23型靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度高；重復(fù)性好交叉污染風(fēng)險(xiǎn)極低，假陽(yáng)性率低提取試劑，芯片閱讀儀均有證PCR擴(kuò)增體系預(yù)分裝儀器運(yùn)轉(zhuǎn)中操作者可休息顯色斑點(diǎn)大，易于判讀亞能產(chǎn)品與凱普的比較優(yōu)勢(shì)使用普通雜交儀125項(xiàng)目基因芯片（亞能）雜交捕獲技術(shù)原理PCR+反向點(diǎn)雜交+化學(xué)顯色分子雜交＋化學(xué)顯色，無(wú)需基因擴(kuò)增理論耗時(shí)6小時(shí)4.5小時(shí)標(biāo)本來(lái)源宮頸脫落細(xì)胞、疣體組織、病理石蠟切片，液基細(xì)胞學(xué)樣本等宮頸脫落細(xì)胞，液基細(xì)胞學(xué)樣本等基本設(shè)備離心機(jī)、普