基于固相微萃取技術(shù)偶聯(lián)gc-ms技術(shù)的霞多麗干葡萄酒香氣量化分析

中國葡萄酒產(chǎn)品植物化學(xué)成分研究現(xiàn)狀風(fēng)味是葡萄酒產(chǎn)品風(fēng)格和特點(diǎn)的一個(gè)重要方面。目前,葡萄酒中已發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性成分有1000種之多,它們的含量從數(shù)百mg/L到幾ng/L[1~2],產(chǎn)品中香氣成分的組成及其含量受多種因素影響,如葡萄品種、產(chǎn)地、生態(tài)條件、栽培管理措施、釀造工藝、陳釀條件等。研究葡萄酒香氣特征及對(duì)其貢獻(xiàn)的化合物,對(duì)于探索葡萄酒香氣成分的呈香機(jī)理,客觀預(yù)測產(chǎn)品風(fēng)格、特色有重要意義。最近幾年關(guān)于地理標(biāo)志葡萄酒產(chǎn)品的典型香氣成分研究報(bào)道較多,Niagara半島霞多麗的典型化學(xué)成分研究認(rèn)為產(chǎn)地是決定該產(chǎn)品特征的主要因素?，F(xiàn)代葡萄酒產(chǎn)業(yè)在中國剛剛興起,絕大多數(shù)釀造葡萄品種是從歐洲引進(jìn)的歐亞種釀酒葡萄,霞多麗是我國主要產(chǎn)區(qū)均有栽培的白色釀酒品種。已有研究從霞多麗葡萄酒中鑒定出的香氣成分有140種,根據(jù)香氣成分氣味活性理論,只有濃度超過其嗅覺閾值的成分才能產(chǎn)生香氣,霞多麗葡萄酒中僅有幾十種對(duì)其整體香氣有貢獻(xiàn)。對(duì)美國加州霞多麗葡萄酒的研究表明,其果香和花香特征與乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯和里哪醇的含量相關(guān)。法國勃艮第產(chǎn)品霞多麗葡萄酒中香氣成分經(jīng)二氯甲烷萃取,然后GC-O分析得出11種香氣成分是其典型香氣的潛在貢獻(xiàn)成分,其中的7種鑒定結(jié)果是香草醛、丁二酮、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、肉桂酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。另外一項(xiàng)類似研究用GC-O和GC-MS得出與霞多麗葡萄酒特有香氣特征聯(lián)系緊密的有10種香氣成分。我國昌黎產(chǎn)區(qū)霞多麗葡萄酒的典型香氣成分研究得出13種活性氣味成分。國家原產(chǎn)地域產(chǎn)品保護(hù)政策已經(jīng)引入我國地理標(biāo)志葡萄酒產(chǎn)品,中國葡萄酒的感官特點(diǎn)越來越受國內(nèi)外同行的關(guān)注,但是有關(guān)中國地理標(biāo)志葡萄酒產(chǎn)品的典型感官特征及其對(duì)應(yīng)化學(xué)成分的研究報(bào)道很少,二者之間的關(guān)聯(lián)分析更少。因此,本文以我國主要產(chǎn)區(qū)的霞多麗干白葡萄酒產(chǎn)品為研究對(duì)象,量化分析葡萄酒的香氣特征和香氣成分,對(duì)應(yīng)分析它們之間的相關(guān)性,確定我國霞多麗干白葡萄酒的典型香氣特征,建立典型香氣特征與香氣成分之間的回歸預(yù)測模型。1材料和方法1.1生產(chǎn)、轉(zhuǎn)罐、裝瓶、貯藏霞多麗(Chardonnay)單品種葡萄酒樣品在我國昌黎、沙城、賀蘭山東麓(銀川)、新疆瑪納斯和云南彌勒5個(gè)產(chǎn)區(qū)采集,樣品由中糧華夏葡萄釀酒有限公司(昌黎)、容晨葡萄酒有限公司(沙城)、寧夏玉泉營葡萄釀酒有限公司(賀蘭山東麓)、新天葡萄釀酒有限公司(新疆瑪納斯)和云南紅葡萄釀酒有限公司(云南彌勒)提供。葡萄酒年份為2006~2009年。以上5個(gè)產(chǎn)區(qū)合作酒廠在自有葡萄園中采摘正常成熟的霞多麗葡萄原料(18~20°Brix),立即進(jìn)行除梗破碎,壓榨取汁時(shí)加入膨潤土和PVPP(釀酒用輔料)澄清葡萄汁,然后按45mg/L加入SO2,常溫下在不銹鋼罐中浸漬24h,添加酵母菌(Sacharomycescerevisia)啟動(dòng)發(fā)酵,酒精發(fā)酵溫度控制在18~20℃,根據(jù)原料含糖量添加白砂糖,所釀酒酒精含量控制在(11±1)%。酒精發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒轉(zhuǎn)入新罐,按75mg/L添加SO2,保持在15℃條件下貯藏,隨后葡萄酒進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)罐、穩(wěn)定處理工藝步驟,次年4月份裝瓶,瓶貯3~6個(gè)月。各產(chǎn)區(qū)每年份樣品隨機(jī)抽取3個(gè)批次各采集3瓶,共180瓶。供試樣品常規(guī)理化指標(biāo),如還原糖、酒精度、FSO2和TSO2含量、干浸出物含量、滴定酸含量、pH值和揮發(fā)酸含量等,檢測結(jié)果均符合國家葡萄酒產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)(GB15037—2006)。1.2固相微萃取裝置GC-MS儀器:TRACEDSQ,Thermo-Finnigan公司,美國;色譜柱:DB-Wax毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.25μm,J&W,Folsom,USA);固相微萃取裝置:SPME,Supelco公司,美國;固相萃取纖維:PDMS(100μmPolydimethylsiloxane),Supelco公司,美國。常規(guī)試劑購于西安化學(xué)試劑廠,香氣成分標(biāo)樣購于Sigma-Aldrich(北京),具體信息見表1。1.3萃取纖維-gc-ms分析在15mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中加入10mL葡萄酒或標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按2.0g/L加入NaCl,然后將頂空瓶放入電磁攪拌器上水浴,40℃平衡10min,打開攪拌器開關(guān),插入萃取纖維,40℃吸附30min,立即將萃取頭在GC進(jìn)樣口解吸3min,用于GC-MS分析。每個(gè)酒樣的萃取操作重復(fù)2次。1.4質(zhì)譜條件載氣:He,流速為1mL/min。柱溫升溫程序:40℃保持3min,然后以4℃/min升至160℃,再以7℃/min升至230℃,保持8min。樣品注射體積為1μL,不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜范圍:33~450amu,連接桿溫度230℃,進(jìn)樣口溫度250℃。離子源溫度230℃,電子源電離轟擊,電子源電壓70eV,燈絲流量為0.20mA,檢測器電壓為350V,質(zhì)譜掃描范圍為33~450amu,掃描頻率1Hz。1.5內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法色譜峰定性分析:采用與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間對(duì)比、與文獻(xiàn)某類物質(zhì)保留指數(shù)對(duì)比的方法確認(rèn)。定量分析:采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,3-辛醇用作內(nèi)標(biāo)物質(zhì),標(biāo)準(zhǔn)曲線采用五點(diǎn)法繪制。定量采用目標(biāo)化合物的特征離子峰面積插值法計(jì)算,對(duì)于沒有標(biāo)準(zhǔn)化合物的定性目標(biāo)峰,采用與目標(biāo)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量相近化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。1.6葡萄酒香氣特征的測定嗅覺閾值測定:香氣成分標(biāo)準(zhǔn)品溶解于模擬酒溶液(酒精度12%、酸度5g/L和pH值3.2)中,隨機(jī)選取20名評(píng)定人員進(jìn)行嗅覺實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)樣品采用三角品嘗法設(shè)計(jì)。目標(biāo)香氣化合物溶液按2的指數(shù)倍稀釋,50%的品嘗員能感知到的最低濃度就是目標(biāo)化合物的嗅覺閾值。同時(shí),記錄香氣化合物的氣味特征。感官分析:葡萄酒感官量化分析采用文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。品嘗小組由30名葡萄酒專業(yè)的學(xué)生組成,感官分析前品嘗組用葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)香氣物質(zhì)訓(xùn)練,直至品嘗組葡萄酒香氣特征辨別分析結(jié)果的偏差小于整體平均值的5%。品嘗組一次分析6款酒樣,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),共兩輪,常溫20℃,黑色郁金香杯盛放酒樣30mL,玻璃蓋蓋嚴(yán),每樣重復(fù)兩次,30min內(nèi)完成。品嘗員聞香靜止酒樣5~8s,然后晃動(dòng)酒杯聞香5~10s,兩樣聞香操作間隔1~2min。要求用葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)香氣里的5~6個(gè)特征詞匯描述樣品香氣特征,并用五點(diǎn)標(biāo)度法對(duì)每一香氣特征進(jìn)行量化。某一香氣特征的最終量化強(qiáng)度值綜合品嘗組對(duì)這一香氣特征詞匯的使用頻率和強(qiáng)度平均值的信息,量化強(qiáng)度值計(jì)算公式為式中M———量化強(qiáng)度值,%I———強(qiáng)度平均值,%F———使用頻率,%2結(jié)果與討論2.1香氣特征與整體感官質(zhì)量根據(jù)已有香氣和整體感官分析結(jié)果,霞多麗葡萄酒和其他單品種酒之間存在感官差異。感官量化分析得出中國5個(gè)產(chǎn)區(qū)霞多麗干白葡萄酒產(chǎn)品的香氣特征,表2中共有27種香氣特征量化數(shù)據(jù)和整體感官質(zhì)量得分。一些香氣特征具有很高的量化強(qiáng)度值,如青蘋果、菠蘿,一些特征量化強(qiáng)度值很低,如哈密瓜。相關(guān)分析用來闡明這些香氣特征與整體感官質(zhì)量之間的關(guān)系,t檢驗(yàn)顯著性結(jié)果見表2。19種香氣特征與整體感官質(zhì)量正相關(guān),8種負(fù)相關(guān)。0.05水平正相關(guān)的香氣特征有菠蘿、柑橘和紫羅蘭。主成分分析(PCA)也用來進(jìn)一步確認(rèn)這些香氣特征與整體感官質(zhì)量之間的關(guān)系,前兩個(gè)主成分分別代表整體方差的39.1%和27.5%,如圖1所示。第一主成分作為質(zhì)量主成分,供試酒樣整體感官質(zhì)量與柑橘、石灰水、菠蘿、紫羅蘭、青蘋果和檸檬等香氣特征正相關(guān),并且聚集在一起,這6個(gè)香氣特征可以作為中國霞多麗葡萄酒產(chǎn)品的典型香氣特征。奶酪、貓尿、雜醇、蘑菇、哈密瓜和覆盆子等聚集在感官質(zhì)量向量的對(duì)面,與感官質(zhì)量負(fù)相關(guān)。霉菌、茴香、蜂蜜、桃處聚集在質(zhì)量向量的正90°位置,其對(duì)面負(fù)90°位置有青草和薄荷香氣特征,因此可以認(rèn)為它們對(duì)中國霞多麗干白典型香氣沒有影響。堅(jiān)果、梨、草莓和多酚等雖然與質(zhì)量向量方向一致,但由于距離和角度較遠(yuǎn),貢獻(xiàn)不大。乳酸、牛奶、甜水果、酸水果和香蕉等位置與原點(diǎn)很近,對(duì)質(zhì)量影響也不大。2.2香氣化合物檢測圖2是模擬葡萄酒溶液中混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC-MS總離子流圖,圖3是2008年昌黎產(chǎn)區(qū)霞多麗干白葡萄酒香氣成分的GC-MS總離子流圖。供試酒樣SPME-GC-MS檢測分析結(jié)果見表3,共有64種香氣成分,質(zhì)量濃度在1μg/L~249mg/L范圍,各品種酒品香氣化合物總質(zhì)量濃度在247.591~450.840mg/L之間,主要香氣成分是高級(jí)醇、化學(xué)酯和脂肪酸,其他微量化合物是萜烯類化合物和去甲類異戊二烯類化合物。但是,香氣成分的濃度與其實(shí)際的香氣貢獻(xiàn)沒有直接的聯(lián)系,而與其氣味活性值(質(zhì)量濃度與閾值的比值,OAV)有關(guān)。雖然OAV沒有考慮香氣成分之間的疊加和抑制作用,但它卻是目前估計(jì)單個(gè)香氣成分實(shí)際氣味貢獻(xiàn)的客觀方法[13~14]。供試葡萄酒樣品香氣成分的氣味特征描述見表3,64種香氣成分中有25種的OAV大于1。2.2.1香氣強(qiáng)度分析酯類是葡萄酒中重要的氣味成分,賦予葡萄酒果香和花香。本文鑒定出3種酯類:乙酸酯、乙醇酯和其他酯,它們是供試霞多麗葡萄酒的重要呈香成分。26種酯類化合物中,12種OAV大于1?，敿{斯、沙城和彌勒葡萄酒含有較高的芳香酯OAV值,因此具有較高強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)香氣強(qiáng)度。Gil分析了西班牙馬德里產(chǎn)區(qū)白葡萄酒和桃紅葡萄酒中的香氣成分,發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯和異戊醇比其他酯類具有更高的OAV值。本研究中,辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯是重要的芳香酯,因?yàn)樗鼈冚^高的OAV值,賦予葡萄酒強(qiáng)烈的果香(如香蕉、草莓、菠蘿和梨)。乙酸乙酯和辛酸異戊酯也在所有供試樣品中存在,但其OAV值不高。一些僅在個(gè)別樣品中存在的重要芳香酯有:乙酸苯乙酯(愉悅的花香)、DL-3-羥基丁酸乙酯(甜瓜香氣)、乳酸乙酯(乳酸風(fēng)味)、2-羥基-4-甲基異戊酸乙酯(甜果味)和辛酸異戊酯(奶油和奶酪芳香)。2.2.2高級(jí)醇的量化有研究得出對(duì)葡萄酒香氣有貢獻(xiàn)的高級(jí)醇有:丁醇、異丁醇、異戊醇、己醇、戊醇、苯甲醇、苯乙醇和己烯醇[16~17]。高級(jí)醇占供試樣品中檢測揮發(fā)性成分的絕大部分,占總體含量的70%。然而,在20種量化高級(jí)醇中,僅有5種OAV值大于1,表明高級(jí)醇對(duì)整體香氣質(zhì)量的貢獻(xiàn)并不高。5種典型高級(jí)醇是:異丁醇、異戊醇、己醇、(Z)-3-己烯-1-醇和苯乙醇,且僅異戊醇在所有供試葡萄酒中具有活性。除了苯乙醇具有花香外,其余均對(duì)葡萄酒香氣具有負(fù)面影響。2.2.3脂肪酸對(duì)葡萄酒香氣平衡的影響在葡萄酒中已報(bào)道的脂肪酸有異丁酸、丁酸、異戊酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸和月桂酸。本研究檢測出樣品中6種有機(jī)酸,根據(jù)它們的OAV值,己酸、辛酸和癸酸具有活性。它們?cè)诘蜐舛葧r(shí)散發(fā)奶酪和奶油的風(fēng)味,而在高濃度時(shí)有腐敗和刺激味。雖然C6-C10脂肪酸常與葡萄酒的不良風(fēng)味有聯(lián)系,但是它們對(duì)葡萄酒的香氣平衡有重要作用,因?yàn)槟軌蛞种茖?duì)應(yīng)芳香酯的水解。Shinohara研究發(fā)現(xiàn)4~10mg/L的C6-C10脂肪酸能夠給葡萄酒帶來適度的和愉悅的香氣,而高于20mg/L就會(huì)有不良?xì)馕丁４蠖鄶?shù)情況下,C6-C10脂肪酸的平均濃度低于11mg/L,對(duì)整體香氣質(zhì)量有正面作用。本研究中,銀川、昌黎和沙城葡萄酒中的脂肪酸質(zhì)量濃度在6.6~10.4mg/L之間,對(duì)整體香氣有正面作用。瑪納斯葡萄酒中脂肪酸含量超過11mg/L,彌勒葡萄酒中脂肪酸含量達(dá)到30mg/L,因此它們對(duì)霞多麗葡萄酒香氣的負(fù)面影響顯而易見。2.2.4去甲類異戊二烯化合物去甲類異戊二烯化合物是源自類胡蘿卜素的重要?dú)馕冻煞?該類化合物中α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮和β-大馬酮是葡萄酒中常見的。它們是葡萄酒中的微量化合物,質(zhì)量濃度低于10μg/L,但是它們的嗅覺閾值極低,在0.05~0.09μg/L之間,因此去甲類異戊二烯化合物通常在葡萄酒中具有活性。本研究中β-大馬酮出現(xiàn)在所有樣品中,而α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮僅在沙城葡萄酒中檢出。2.2.5單類化合物的檢測萜烯類化合物屬于植物的二次代謝產(chǎn)物,其合成開始于乙酰-輔酶A(CoA)。萜烯類化合物在酒精發(fā)酵期間不受酵母菌活動(dòng)的影響。很多研究報(bào)道,萜烯類化合物可以反映葡萄栽培品種的特性。根據(jù)葡萄汁中單萜類化合物的含量,粗略的可將葡萄品種分為:芳香型玫瑰香系列品種,游離單萜含量可達(dá)到6mg/L:非玫瑰香系列芳香型品種,游離單萜含量1~4mg/L:中性品種,香氣不依賴于單萜類化合物。葡萄酒中單萜類化合物絕大多數(shù)是萜烯醇。霞多麗屬于中性品種,本研究中檢出5種萜烯醇,里哪醇、4-萜品醇、香茅醇、trans-香葉醇和trans-橙花叔醇。所有樣品中里哪醇含量均超過其嗅覺閾值,賦予葡萄酒玫瑰香和果香。trans-香葉醇僅在瑪納斯葡萄酒中有活性。從萜烯醇的OAV值可以看出,瑪納斯葡萄酒的玫瑰香、花香和柑橘香氣最強(qiáng),彌勒葡萄酒源于萜烯醇的香氣次之。2.2.6-2,4-季丁基-苯酚,蒸發(fā)石碳酸味苯酚除了以上幾類香氣成分之外,本文在彌勒葡萄酒中還檢測出一種活性揮發(fā)性酚,2,4-季丁基-苯酚,散發(fā)石碳酸味。葡萄酒中活性揮發(fā)性酚有愈創(chuàng)木酚、甲酚、乙基苯酚、丁子香酚和香草醛,這些化合物主要是來源于橡木陳釀的成分,本研究供試酒樣沒有進(jìn)行橡木陳貯,所以沒有檢測出這類成分。2.3香氣成分模型的建立感官香氣特征來源于對(duì)其貢獻(xiàn)的香氣成分,因此有研究試圖建立香氣成分與感官特征之間的數(shù)學(xué)聯(lián)系。一項(xiàng)有關(guān)美國加州霞多麗葡萄酒果香和花香特征的研究認(rèn)為,香氣特征的強(qiáng)弱與乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、里哪醇和兩個(gè)具有薄荷、焦糖氣息的未知化合物相關(guān)。Azar等用揮發(fā)性成分建立紅葡萄酒香氣特征的預(yù)測模型,模型確認(rèn)化學(xué)成分與氣味特征之間存在復(fù)雜的多元關(guān)系,但在該研究中沒有進(jìn)行品嘗員的專門培訓(xùn),且感官量化數(shù)據(jù)僅是香氣特征的使用頻率。本文中,品嘗員用葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)香氣物質(zhì)進(jìn)行培訓(xùn),所用特征詞匯來源于標(biāo)準(zhǔn)香氣物質(zhì)。經(jīng)過對(duì)香氣量化數(shù)據(jù)的主成分分析和相關(guān)分析篩選得到中國5個(gè)產(chǎn)區(qū)霞多麗葡萄酒的典型香氣特征。進(jìn)行單個(gè)典型香氣特征矩陣(Y)與香氣成分矩陣(X)之間的回歸分析,回歸模型表示為進(jìn)入模型的xi是對(duì)香氣特征y有影響的成分,bi體現(xiàn)的是xi貢獻(xiàn)的大小和正負(fù),以及與其他進(jìn)入模型成分的關(guān)系,b0起校正作用。本研究采用供試葡萄酒中的香氣成分建立典型香氣特征強(qiáng)度的預(yù)測模型?；貧w方程的方差分析結(jié)果見表4,除了青蘋果模型的回歸方差在0.05水平上顯著,其他模型在0.01水平上顯著。表5提供的是進(jìn)入每一模型的常數(shù)項(xiàng)、香氣成分的系數(shù)、t檢驗(yàn)結(jié)果以及實(shí)測值和預(yù)測值之間的相關(guān)系數(shù)(R2)。青蘋果模型里,僅進(jìn)入一個(gè)化合物,異戊醇,對(duì)香氣強(qiáng)度作正面貢獻(xiàn),t檢驗(yàn)顯示其常數(shù)項(xiàng)不顯著,R2值小于0.90。其他5個(gè)香氣特征模型里,各