活體成像技術(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與應(yīng)用介紹

活體成像技術(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與應(yīng)用介紹內(nèi)容簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的注意事項(xiàng)應(yīng)用介紹內(nèi)容簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的注意事項(xiàng)應(yīng)用介紹一、活體成像技術(shù)簡(jiǎn)介一、活體成像技術(shù)簡(jiǎn)介定義:

活體狀態(tài)下在細(xì)胞和分子水平上應(yīng)用影像學(xué)方法對(duì)生物過程進(jìn)行空間和時(shí)間上的定性、定量分析研究的一門科學(xué)?；铙w成像定義Dr.RalphWeissleder定義:活體狀態(tài)下在細(xì)胞和分子水平上應(yīng)用影像學(xué)方法對(duì)生物過程細(xì)菌感染模型建立金黃色葡萄球菌細(xì)菌感染模型建立金黃色葡萄球菌熒光標(biāo)記探針靶向細(xì)菌DPA-Cy7熒光標(biāo)記探針靶向細(xì)菌DPA-Cy7熒光成像在細(xì)菌研究中的應(yīng)用Pre-injectionPost-injection6h12h18h21hLeevy,W.M.;Marquez,M.;Piwnica-Worms,D.;Smith,B.D.BioconjugateChem.2008,19,686–692.熒光成像在細(xì)菌研究中的應(yīng)用Pre-injectionPost終極方法無損傷性直觀形象活體成像的優(yōu)點(diǎn)終極方法活體成像的優(yōu)點(diǎn)活體成像技術(shù)的應(yīng)用方向藥物材料研究新藥評(píng)價(jià)納米藥物核酸疫苗骨科材料生物材料生命科學(xué)研究腫瘤微生物干細(xì)胞心腦血管疾病模型活體成像技術(shù)的應(yīng)用方向藥物材料研究新藥評(píng)價(jià)納米藥物核酸疫苗骨類型熒光染料激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)課件功能成像結(jié)構(gòu)成像生物發(fā)光熒光成像同位素X光、白光成像對(duì)象細(xì)胞細(xì)胞、分子分子動(dòng)物或器官優(yōu)點(diǎn)噪音低應(yīng)用廣泛影響小結(jié)構(gòu)清晰缺點(diǎn)構(gòu)建繁瑣成本昂貴噪音大資質(zhì)許可無功能信息常用活體成像模式功能成像結(jié)構(gòu)成像生物發(fā)光熒光成像同位素X光、白光成像對(duì)象細(xì)胞功能成像（熒光）與結(jié)構(gòu)成像（X光）的組合運(yùn)用X光成像KodakX-Sight761overlay功能成像（熒光）與結(jié)構(gòu)成像（X光）的組合運(yùn)用X光成像數(shù)碼X光成像的精確定位

-結(jié)構(gòu)成像與功能成像相結(jié)合數(shù)碼X光成像的精確定位CourtesyDr.B.Bednar,MerckCo.Inc.正面成像側(cè)面成像

數(shù)碼X光成像的精確定位

-結(jié)構(gòu)成像與功能成像相結(jié)合CourtesyDr.B.Bednar,Merck多模式活體成像多模式活體成像：成像過程中至少同時(shí)采用一種結(jié)構(gòu)成像和一種功能成像的組合成像方式。結(jié)構(gòu)成像功能成像多模式成像X光＋熒光成像+生物發(fā)光+同位素成像結(jié)構(gòu)成像功能成像CT＋PET+SPECT例如：多模式活體成像多模式活體成像：成像過程中至少同時(shí)采用一種結(jié)構(gòu)多模式活體成像應(yīng)用舉例

---生物發(fā)光、熒光與X光的組合運(yùn)用BackerMV,etal.,2007.Vol13(4),April2007.p504-9.生物發(fā)光、熒光成像和X光成像組合運(yùn)用的成功范例，已成為腫瘤等研究的經(jīng)典方法NatureMedicine多模式活體成像應(yīng)用舉例

ZhiYang,ChunLi,Biomacromolecules2007，8（11）In111-DTPA-CCPM多模式活體成像應(yīng)用舉例

---熒光與同位素成像的組合運(yùn)用ZhiYang,ChunLi,Biomacromol生物發(fā)光（fire），近紅外成像（rainbow），同位素成像（111In-LS308）MolImaging,2009.8(2):p.101-10

多模式活體成像應(yīng)用舉例

---發(fā)光、熒光與同位素成像的共定位生物發(fā)光（fire），近紅外成像（rainbow），同1、熒光成像基態(tài)激發(fā)態(tài)發(fā)射態(tài)激發(fā)光發(fā)射光光能光能1、熒光成像基態(tài)激發(fā)態(tài)標(biāo)記生物大分子：蛋白、抗體、多肽、核酸；標(biāo)記小分子化合物：小分子化合物；標(biāo)記細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等；標(biāo)記納米化藥劑：脂質(zhì)體、膠束等；標(biāo)記其他納米材料：金屬氧化物等;標(biāo)記細(xì)菌：各種感染模型;標(biāo)記臟器：ICG;‘標(biāo)’悍的熒光熒光成像應(yīng)用標(biāo)記生物大分子：蛋白、抗體、多肽、核酸；熒光成像應(yīng)用熒光成像的關(guān)鍵因素—穿透率小鼠不同部位的穿透率熒光成像的關(guān)鍵因素—穿透率小鼠不同部位的穿透率650-850nm是活體成像的核心波段650-850nm是活體成像的核心波段420ex/790em440ex/790em460ex/790em480ex/790em520ex/790em540ex/790em570ex/790em590ex/790em600ex/790em610ex/790em620ex/790em630ex/790em650ex/790em670ex/790em690ex/790em700ex/790em710ex/790em720ex/790em730ex/790emWhiteLightX-Ray波長(zhǎng)對(duì)背景噪音的影響420ex/790em近紅外成像-熒光成像的最佳選擇不同波長(zhǎng)激光筆對(duì)大拇指的透光實(shí)驗(yàn)近紅外成像-熒光成像的最佳選擇不同波長(zhǎng)激光筆對(duì)大拇指的透光實(shí)定義：生物發(fā)光是熒光素酶（Luciferase）以熒光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2為底物，在Mg2＋存在時(shí)發(fā)生酶促反應(yīng)中產(chǎn)生光子的過程。

熒光素+ATP+O2→核黃素磷酸鹽+醛化合物

核黃素磷酸鹽+醛化合物→激發(fā)的絡(luò)合物

激發(fā)的絡(luò)合物→氧化核黃素磷酸鹽+酸+水+光子

化學(xué)能→光能

2、生物發(fā)光定義：生物發(fā)光是熒光素酶（Luciferase）以熒光素生物發(fā)光的應(yīng)用細(xì)胞或細(xì)菌標(biāo)記：腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等記；最新技術(shù)：生物發(fā)光與熒光蛋白雙標(biāo)基因表達(dá)：以融合蛋白的方式標(biāo)記內(nèi)源性蛋白，研究基因表達(dá)情況；蛋白相互作用：將熒光素酶基因分為兩個(gè)片段，分別與要研究的兩個(gè)蛋白融合表達(dá)，兩種蛋白相互靠近后產(chǎn)生發(fā)光。生物發(fā)光的應(yīng)用細(xì)胞或細(xì)菌標(biāo)記：腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等記；3、X-Ray成像0.0mm0.1mm0.2mm0.4mm0.8mm1.41.61.82.12.5Binning1x1,Acq.Time100sBone/SoftTissue3、X-Ray成像0.0mm0.1mm0.2mm0.二、活體成像實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)二、活體成像實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)活體成像實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理論方面：成像模式的選擇：結(jié)構(gòu)成像與功能成像組合不同研究水平的相互組合：活體、離體、分子水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)踐方面：染料的選擇：類型、波長(zhǎng)…標(biāo)記方法的選擇：共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵、脂質(zhì)體…熒光單一波長(zhǎng)與多光譜分析選擇:近紅外…熒光素酶基因標(biāo)記的細(xì)胞株活體成像實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理論方面：不同研究水平的相互組合三個(gè)水平一致的數(shù)據(jù)，才是更加真實(shí)有效的數(shù)據(jù)?；铙w水平離體臟器水平細(xì)胞分子水平不同研究水平的相互組合三個(gè)水平一致的數(shù)據(jù)，才是更加真實(shí)有效的近紅外熒光染料舉例類型熒光染料激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)(nm)親水染料ICG795/835Cy系列（如CY7）CY7：743/770Alexa系列（如750）750：749/775疏水染料DiR748/780稀土染料Er980/655QdotQdot800450/800近紅外熒光染料舉例類型熒光染料激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)(nm)親水染料報(bào)告基因的選擇成像模式基因激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)(nm)說明生物發(fā)光Fluc560需要注射底物Rluc475需要注射底物熒光mKate2588/633近紅外波段TagRFP555/584紅/橙TagYFP508/524黃TagGFP2483/506綠注：熒光蛋白的信息來源于報(bào)告基因的選擇成像模式基因激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)(nm)說明生物發(fā)光注射麻醉：腹腔注射：如戊巴比妥鈉（1%，7μL/g）氣體麻醉：小動(dòng)物麻醉機(jī)：如異氟烷（2-5%）動(dòng)物麻醉方式的選擇注射麻醉：動(dòng)物麻醉方式的選擇注意事項(xiàng)：小動(dòng)物麻醉程度適度：麻醉過深加大死亡概率、劑量不足會(huì)出現(xiàn)抽搐反復(fù)麻醉易導(dǎo)致死亡；注意麻醉動(dòng)物的保溫小動(dòng)物存在種屬和個(gè)體差異，不同動(dòng)物模型使用劑量不同戊巴比妥等麻醉劑溶液長(zhǎng)時(shí)間放置容易失去藥效。注意事項(xiàng)：脫毛方式：剃刀、電動(dòng)剃毛器化學(xué)脫毛劑脫毛劑：人用脫毛劑-帶自發(fā)熒光自配脫毛劑：8%NaS+30%無水乙醇注意事項(xiàng)：

適量涂抹；清洗；適量配備；低溫、避光、密閉保存；脫毛原因：熒光拍攝時(shí)毛發(fā)產(chǎn)生背景噪音

并影響光的穿透脫毛方法的選擇脫毛方式：脫毛方法的選擇LOGO底物注射方式：一般通過腹腔注射打入底物(150μg/g)，偶爾也可原位注射;生物發(fā)光時(shí)間：注射底物約一分鐘后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光；十五分鐘后強(qiáng)度達(dá)到最高；發(fā)光持續(xù)時(shí)間：最高點(diǎn)持續(xù)約20～30分鐘后開始衰落，約三小時(shí)后發(fā)光全部消失；最佳檢測(cè)時(shí)間：注射后12到25分鐘之間;麻醉時(shí)間：發(fā)光底物注射后7-8min開始麻醉;生物發(fā)光成像時(shí)間點(diǎn)的選擇LOGO底物注射方式：一般通過腹腔注射打入底物(150LOGO文獻(xiàn)檢索染料的激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)和特點(diǎn)體外用多光譜拍攝模式尋找最佳激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)和最適濃度。使用黑色底透板拍攝（costar，貨號(hào)3603），EP管對(duì)結(jié)果有一定影響體外數(shù)據(jù)作為參考，在體拍攝預(yù)實(shí)驗(yàn)也要用多廣譜拍攝再優(yōu)化一下拍攝參數(shù)（光的穿透和背景噪音等的影響）熒光成像實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)LOGO文獻(xiàn)檢索染料的激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)和特點(diǎn)熒光成像實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)的重要性一、預(yù)實(shí)驗(yàn)前的工作：動(dòng)物模型的建立：荷瘤模型、疾病模型……儀器兼容性：配套濾光片……待用的試劑和耗材：麻醉劑、脫毛膏、注射器、手術(shù)工具等……二、預(yù)實(shí)驗(yàn)中的工作：了解動(dòng)物：動(dòng)物模型、熒光背景、麻醉、脫毛等了解標(biāo)記物：如熒光及發(fā)光強(qiáng)度、純度、濃度了解自己的實(shí)驗(yàn)操作能力：尾靜脈注射了解儀器：拍攝參數(shù)確定和程序設(shè)置了解拍攝時(shí)間點(diǎn)：研究對(duì)象體內(nèi)半衰期預(yù)實(shí)驗(yàn)的重要性一、預(yù)實(shí)驗(yàn)前的工作：LOGO注意對(duì)照的選擇，特別是自身對(duì)照（給藥前拍一下本底）和陰性對(duì)照，有條件的還要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照Protocol拍攝后應(yīng)立即簡(jiǎn)單做一下疊加，以免動(dòng)物小幅度爬動(dòng)影響圖像的疊加動(dòng)物有可能會(huì)排泄，所以看到明顯的雜信號(hào)時(shí)，最好在那個(gè)部位用酒精等擦拭一下拍攝不同臟器時(shí)，注意多選幾個(gè)體位注意離體臟器數(shù)據(jù)的收集，必要時(shí)固定、切片正式實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)LOGO注意對(duì)照的選擇，特別是自身對(duì)照（給藥前拍一下本三、活體成像應(yīng)用舉例三、活體成像應(yīng)用舉例熒光成像在納米材料研究的應(yīng)用MedarovaZ,etal.,2007.Vol13(3),March2007.p372-7.熒光成像在納米材料研究的應(yīng)用MedarovaZ,eta納米材料介導(dǎo)的腫瘤藥物主動(dòng)靶向納米材料介導(dǎo)的腫瘤藥物主動(dòng)靶向腫瘤藥物靶向性實(shí)驗(yàn)0h2h4h6h8h12h24h32h36h48h72h58h腫瘤藥物靶向性實(shí)驗(yàn)0h2h4h6h8h12h2腫瘤藥物注射11h時(shí)生物發(fā)光、熒光與X光圖像疊加。BLINIRFMerge腫瘤藥物靶向