elisa方法檢測(cè)hbsag的影響因素

目前，我國(guó)最流行的方法是對(duì)肝腎雙重半（hbv血清功能指數(shù)hbsag、hbsa、hbeag、hbeag和hbcag）進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa），但同一人在不同醫(yī)院的科學(xué)研究報(bào)告可能會(huì)不同。同一樣本可以由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的兩名成員執(zhí)行。而乙肝兩對(duì)半作為乙肝的一項(xiàng)重要檢測(cè)指標(biāo),對(duì)臨床醫(yī)生為病人設(shè)計(jì)治療方案影響很大,因此,提高乙肝兩對(duì)半檢測(cè)的準(zhǔn)確性顯得尤為重要。影響乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果的因素很多,根據(jù)多年實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn),筆者認(rèn)為可以從以下幾大方面加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。1儀器正常運(yùn)行ELISA方法檢測(cè)乙肝兩對(duì)半所用的儀器有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、全自動(dòng)加樣機(jī)等,日常操作應(yīng)保證各儀器的正常運(yùn)行,每年檢修1次。移液器每隔一段時(shí)間應(yīng)校正1次,冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱每日有專(zhuān)人記錄其內(nèi)部溫度,冰箱中應(yīng)放入冰袋,以免停電后溫度上升時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而使酶失活。2同一廠家試劑不使用過(guò)期的試劑,正規(guī)廠家生產(chǎn)的試劑盒上都有生產(chǎn)日期和過(guò)期日期,應(yīng)用在保質(zhì)期內(nèi)的產(chǎn)品。具體操作前,室溫平衡20～30min,用完后立即放入4℃冰箱中。由于質(zhì)量好壞對(duì)報(bào)告產(chǎn)生重大影響,應(yīng)選用其產(chǎn)品被各大醫(yī)院長(zhǎng)期使用并認(rèn)同的的知名廠家所生產(chǎn)的試劑。另外由于生產(chǎn)廠家不同,試劑的靈敏度也有所不同,有1、2、5ng/ml不等,這對(duì)低水平的樣品會(huì)有影響,因此,選用同一廠家的試劑,有利于提高各實(shí)驗(yàn)室之間的重復(fù)性和可比性。例如,池曉霞等報(bào)道1029例HBsAg陽(yáng)性患者中,HBsAg濃度在5μg/L以下者就有312例(2.73%),其中HBsAg含量<1μg/L者有147例(47.12%),1～2μg/L的有61例(19.55%),2～5μg/L的有104例(33.33%)。可見(jiàn)低水平血清HBsAg人群不容忽視,重視并提高HBsAg檢測(cè)靈敏度有重要意義。3月和8月hbeag試驗(yàn)樣品存放時(shí)間對(duì)血清保存時(shí)間及條件直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。何印蕾等報(bào)道,在室溫下保存的血清標(biāo)本HBsAg從第9天、HBeAg從第7天、HBsAb從第5天開(kāi)始發(fā)生明顯變化(均P<0.01);在4～8℃保存的血清標(biāo)本HBsAg從第14天、HBsAb從第7天、HBeAg從第14天開(kāi)始發(fā)生明顯變化(均P<0.01)。在-80℃低溫冰箱保存的血清標(biāo)本HBV血清標(biāo)記物在4個(gè)月內(nèi)均保持穩(wěn)定(均P>0.05)。溶血程度和紅細(xì)胞對(duì)乙肝兩對(duì)半的檢測(cè)結(jié)果影響也很大,當(dāng)溶血程度和紅細(xì)胞濃度越高時(shí),出現(xiàn)HBsAg、HBsAb、HBeAg假陽(yáng)性的可能就越大。溫洪周等報(bào)道,當(dāng)紅細(xì)胞達(dá)到0.25×1012/L時(shí),有100%的HBsAg、96%的HBsAb、98%HBeAg為假陽(yáng)性。因此,當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)“HBsAg+,HBsAb+,HBeAg+”等不易解釋的模式時(shí),可考慮樣品是否有溶血。而HBsAg+或HBsAb+或HBcAb+的標(biāo)本,也可能是因?yàn)槿苎霈F(xiàn)假陰性的結(jié)果。因此,樣品最好及時(shí)檢測(cè),若不能及時(shí)檢測(cè),應(yīng)根據(jù)需要放在不同溫度的冰箱中。采血時(shí)動(dòng)作不能過(guò)猛,以防止溶血。另外,要注意兒童的抽血量不能過(guò)少。4操作步驟4.1移液槍作標(biāo)準(zhǔn)量加樣加樣過(guò)程中,樣品不可過(guò)多也不可過(guò)少,否則都會(huì)影響結(jié)果,應(yīng)用移液槍作標(biāo)準(zhǔn)量加樣,同時(shí)盡量不要吸到纖維蛋白原,以免洗板時(shí)堵塞洗板機(jī)吸頭,或洗板機(jī)洗不去沉淀的纖維蛋白原而影響了顯色結(jié)果。4.2影響顯色裝置的工作原理一般試劑盒的酶都有滴瓶,說(shuō)明中有的要求加1滴酶,有的要求加50μl,但建議用移液槍作標(biāo)準(zhǔn)量滴加。因?yàn)橹苯佑玫纹康螘r(shí),因角度不同,瓶口大小,用力大小等都會(huì)影響滴下的試劑量,而且經(jīng)常會(huì)滴在兩孔之間造成洗板機(jī)無(wú)法洗去而影響顯色。另外,移液槍的槍頭務(wù)必一次性使用,不可重復(fù),因?yàn)榧词瓜磧艉蟾邷叵疽矔?huì)因?yàn)樽冃味?影響了加樣的準(zhǔn)確度。4.3空氣氧化法嚴(yán)格按照說(shuō)明操作,若時(shí)間過(guò)短,可能產(chǎn)生假陰性;時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能因空氣氧化而產(chǎn)生假陽(yáng)性;溫度過(guò)高,酶易失活,而溫度過(guò)低,也可能產(chǎn)生假陰性。4.4清洗液的使用目前,一般大醫(yī)院都采用自動(dòng)洗板機(jī)洗板,要注意的是有些血清中有纖維蛋白原或氣泡,應(yīng)在洗板后再用清水沖洗,拍干。清洗液按說(shuō)明配制,每次使用前保證有足夠的清洗液,否則會(huì)造成嚴(yán)重的假陽(yáng)性;廢液要及時(shí)倒去,否則會(huì)損傷洗板機(jī)或有的洗板機(jī)干脆停止工作。另外,廢液瓶應(yīng)加入84消毒劑,而清洗液瓶中千萬(wàn)不可用84等氧化劑消毒,否則結(jié)果呈全部陽(yáng)性。4.5因震動(dòng)的震動(dòng)將ELISA板放入酶標(biāo)儀一定要按平,否則因不平引起的震動(dòng)會(huì)使孔中的有色液體濺出,甚至濺到相鄰的孔中,使全部工作功虧一簣;另外,要注意酶標(biāo)儀的除塵,否則也會(huì)影響讀出的結(jié)果。4.6hbcab檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰陽(yáng)對(duì)照,根據(jù)試劑盒的說(shuō)明報(bào)結(jié)果。但是,因ELISA方法檢測(cè)HBcAb時(shí)要對(duì)血清做30倍稀釋,使HBcAb結(jié)果的假陽(yáng)性較其他4孔明顯偏高,因此報(bào)結(jié)果時(shí)需參考前面4項(xiàng)指標(biāo)。另外,因?yàn)楦窝椎臐摲谑?個(gè)月,所以乙肝兩對(duì)半的體檢報(bào)告有效期只有3個(gè)月。5對(duì)hbv的pcr檢測(cè)科學(xué)發(fā)展至今,已明確乙肝病毒顆粒由3部分組成,乙肝表面抗原、核心抗原和e抗原,因核心抗原存在于感染病毒的細(xì)胞核內(nèi),因此,在血清中無(wú)法檢測(cè)到,只能在細(xì)胞漿中檢測(cè)到其抗體即HBcAb,以及HBsAg,HBeAg及其抗體,因此,我們平時(shí)檢測(cè)的只是叫兩對(duì)半,而不是三對(duì),但可以用PCR方法彌補(bǔ)。PCR不但能檢測(cè)到核心抗原,而且能檢測(cè)出HBV復(fù)制的情況和變異的乙肝病毒。若這2種方法同時(shí)運(yùn)用,相互補(bǔ)充,就能使醫(yī)生綜合評(píng)價(jià)患者病情與用藥療