貝科能對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠心、腦、腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

近年來(lái)，通過(guò)對(duì)心肺恢復(fù)后心臟和大腦的單一器官的研究，發(fā)現(xiàn)肺恢復(fù)后器官急性損傷的原因有很多，但主要是由于心跳驟停期間組織嚴(yán)重缺氧和恢復(fù)后的組織灌溉。全身炎癥反應(yīng)綜合征可能導(dǎo)致多器官功能障礙，然后發(fā)展到多器官功能衰竭（mof），最終死亡。本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠心跳驟停-心肺復(fù)蘇模型,觀察復(fù)蘇后多器官組織細(xì)胞(心肌細(xì)胞、腦神經(jīng)細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞)超微結(jié)構(gòu)的損傷,并用改善線粒體能量代謝的藥物貝科能(復(fù)合輔酶)進(jìn)行干預(yù),評(píng)價(jià)貝科能防治復(fù)蘇后多器官組織細(xì)胞急性損傷的效果,為臨床防治MODS/MOF尋找新的有效藥物。1材料和方法1.1動(dòng)物中心雄性健康SD大鼠24只,體重(274.96±29.59)g,日齡49~60d,由中國(guó)科學(xué)院上海分院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將SD大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(n=8)、常規(guī)復(fù)蘇組(n=8)、貝科能治療組(n=8)。1.2貝科能治療大鼠心肌梗死損傷的臨床組術(shù)前禁食12h,頸部正中切口,行氣管插管,分別于左側(cè)頸外靜脈、右側(cè)頸總動(dòng)脈置管,監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓,監(jiān)測(cè)心電圖及直腸溫度。操作完成并穩(wěn)定30min后經(jīng)頸靜脈注射肌松劑(琥珀酰膽堿,0.15mg/100g)抑制呼吸合并0.5mol/L冰氯化鉀(4℃,0.12ml/100g)停跳液致大鼠心跳驟停,持續(xù)5min后行心肺復(fù)蘇,出現(xiàn)自主心律、脈搏波、收縮壓≥60mmHg,持續(xù)10min以上判定為自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC),自主循環(huán)恢復(fù)2h后逐步撤離呼吸機(jī),拔除氣管插管和動(dòng)靜脈導(dǎo)管并縫合傷口.貝科能治療組于心跳恢復(fù)時(shí)給予貝科能(按1支/10kg)生理鹽水稀釋至0.3ml后腹腔注入,復(fù)蘇后12h再給同等劑量。常規(guī)組腹腔注射生理鹽水0.3ml,對(duì)照組僅進(jìn)行插管等手術(shù)操作,不進(jìn)行心跳驟停和心肺復(fù)蘇。所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì)和記錄均參照實(shí)驗(yàn)研究的Utstein模式。1.3透射電鏡觀察組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)術(shù)后24h取左心室心肌、左側(cè)顳葉皮質(zhì)區(qū)腦皮質(zhì)、左腎上極髓質(zhì)組織,用銳利刀片切成1mm3大小3塊,放入2.5%戊二醛液中固定冷藏,用于透射電鏡觀察組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;并留取心、腦、腎組織液氮冷藏,用于檢測(cè)MDA含量及SOD、Na+-K+-ATPase活力。1.4滿足s100、不能i0.1.3m的玉米貝科能(注射用復(fù)合輔酶)(Biocoen),批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H11020001:輔酶A100單位、輔酶I0.1mg,北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司生產(chǎn);考馬斯亮藍(lán)蛋白、MDA、SOD及Na+-K+-ATPase測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。1.5心、腦、腎組織mda含量、sod活力與atpase活力的測(cè)定1.5.1考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定心、腦、腎組織蛋白質(zhì)含量將考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒附帶的標(biāo)準(zhǔn)蛋白以生理鹽水稀釋成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。取蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和待測(cè)的組織勻漿液各50μl,分別加考馬斯亮蘭染色液3.0ml,混勻,靜置10min,于595nm處,1cm光徑,空白管調(diào)零,測(cè)各管吸光度。以測(cè)定管吸光度與標(biāo)準(zhǔn)管吸光度的比值乘以標(biāo)準(zhǔn)管濃度即得到心、腦、腎組織的蛋白濃度。1.5.2MDA含量的測(cè)定以四已氧基丙烷為MDA標(biāo)準(zhǔn)品,用硫代巴比妥酸法測(cè)定熒光強(qiáng)度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取100g·L-1濃度的心、腦、腎組織勻漿液100μl,在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下反應(yīng),以空白管調(diào)零,測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算心、腦、腎組織MDA含量。1.5.3SOD活力的測(cè)定采用改良的黃嘌呤氧化酶法,分別取10g·L-1心、腦、腎組織勻漿10μl,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,在550nm處比色。按下列公式計(jì)算SOD活力:SΟD活力(U/mg)=對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度對(duì)照管吸光度÷0.5×反應(yīng)液總體積取樣量(ml)÷組織中蛋白量(mg)1.5.4Na+-K+-ATPase活力測(cè)定采用定磷法,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作,規(guī)定每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATPase分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)ATPase活力單位[μmol/(mg·h)]。1.5.5電鏡標(biāo)本檢測(cè)以2.5%戊二醛預(yù)固定,0.1mol/LPBS液漂洗,2%鋨酸后固定2h,酒精丙酮梯度脫水,Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋,制備半薄切片定位后,超薄切片用醋雙氧鈾和檸檬酸染色,日立HE-800透射電鏡下觀察1.6t檢驗(yàn)計(jì)量資料用(ˉx±s)表示,采用兩組間比較的t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有顯著性,以P<0.01為差異有非常顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。2結(jié)果2.1注射停跳藥至改路測(cè)定各組間體重(P=0.519)、實(shí)驗(yàn)開(kāi)始窒息+注射停跳藥至心跳停止的時(shí)間(P=0.859)和心跳停止-心肺復(fù)蘇到恢復(fù)自主循環(huán)的時(shí)間(P=0.529)的參數(shù)比較,差異無(wú)顯著性,見(jiàn)表1。2.2mda和貝科能檢測(cè)復(fù)蘇后24h大鼠心、腦、腎組織中MDA含量較對(duì)照組顯著增高(P<0.05),且常規(guī)復(fù)蘇組心、腦、腎組織中MDA含量顯著高于貝科能組(P<0.05)。而常規(guī)復(fù)蘇組心、腦、腎組織中SOD活力、Na+-K+-ATPase活力顯著低于貝科能組(P<0.05),常規(guī)復(fù)蘇組及貝科能組心、腦、腎組織中SOD活力、Na+-K+-ATPase活力明顯低于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01),差異有顯著性。見(jiàn)表2、3、4。2.3心腦和腎臟組織的變化2.3.1規(guī)復(fù)蘇組對(duì)心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)對(duì)照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常:線粒體無(wú)腫脹,嵴排列整齊,心肌纖維排列規(guī)則。而常規(guī)復(fù)蘇組(圖1A)可見(jiàn)明顯心肌細(xì)胞損傷,細(xì)胞正常形態(tài)消失,核變形、溶解,線粒體腫脹、嵴斷裂、甚至空泡化,心肌纖維斷裂,排列紊亂,部分肌絲溶解。貝科能治療組(圖1B)少數(shù)細(xì)胞線粒體腫脹、部分心肌纖維斷裂,排列尚規(guī)則有序。2.3.2復(fù)蘇組不同部位神經(jīng)電生理檢查對(duì)照組腦神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,可見(jiàn)染色質(zhì)分布均勻,線粒體嵴排列整齊。而常規(guī)復(fù)蘇組可見(jiàn)明顯神經(jīng)細(xì)胞損傷,正常形態(tài)消失,核變形、固縮,線粒體腫脹、嵴斷裂、甚至空泡化,胞漿空泡化,神經(jīng)元脫髓鞘,見(jiàn)圖2A。貝科能治療組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常,少數(shù)線粒體腫脹,見(jiàn)圖2B。2.3.3腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組織結(jié)構(gòu)對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞核橢圓形,染色質(zhì)分布均勻,線粒體嵴排列整齊,無(wú)斷裂,胞漿中可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體。而常規(guī)復(fù)蘇組可見(jiàn)腎小管細(xì)胞損傷明顯,正常形態(tài)消失,可見(jiàn)凋亡小體,線粒體腫脹、嵴斷裂、部分線粒體空泡化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。貝科能治療組可見(jiàn)腎小管細(xì)胞基本完整,少數(shù)細(xì)胞線粒體腫脹、空泡化,見(jiàn)圖3。3復(fù)蘇后心、腦、腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Padanilam認(rèn)為能量代謝障礙是其發(fā)病的基礎(chǔ),自由基的作用和細(xì)胞內(nèi)鈣超載是其重要的發(fā)病環(huán)節(jié)。國(guó)內(nèi)外對(duì)缺血-再灌流的研究大部分局限于單個(gè)器官,且以器官動(dòng)脈夾閉、再通制備缺血-再灌流模型。本研究采用窒息合并冰氯化鉀停跳液致大鼠心跳驟停5min后開(kāi)始心肺復(fù)蘇的動(dòng)物模型,應(yīng)用透射電鏡觀察全身缺血-再灌流后的器官超微結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組心、腦、腎細(xì)胞形態(tài)正常,核完整,染色質(zhì)分布均勻,線粒體嵴排列整齊。而常規(guī)復(fù)蘇后24h組可見(jiàn)明顯細(xì)胞損傷,細(xì)胞正常形態(tài)消失,核變形、溶解,線粒體腫脹、嵴斷裂,甚至空泡化,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張,部分可見(jiàn)凋亡小體。MileiJ等分別對(duì)心、腦、腎在缺血-再灌流后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),缺血-再灌流后心肌細(xì)胞、腦神經(jīng)細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞均發(fā)生了明顯的超微結(jié)構(gòu)改變,發(fā)現(xiàn)再灌流可產(chǎn)生快速的線粒體損傷,包括線粒體腫脹、嵴斷裂,膜滲漏等改變,認(rèn)為再灌流時(shí)組織細(xì)胞暴露于氧自由基、炎性介質(zhì)中,氧化應(yīng)激反應(yīng)使得線粒體受到極度損傷,此改變可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察了心、腦、腎多個(gè)器官超微結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致,而且發(fā)現(xiàn)在心肺復(fù)蘇后24h,這些器官線粒體幾乎發(fā)生了同樣的超微結(jié)構(gòu)病理改變。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)心、腦、腎組織中MDA含量、SOD、Na+-K+-ATPase活力進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,復(fù)蘇后心、腦、腎組織中MDA含量均顯著增高,同時(shí)SOD、Na+-K+-ATPase活力顯著低于對(duì)照組。說(shuō)明氧自由基(OFR)介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、細(xì)胞能量代謝障礙,參與了復(fù)蘇后心、腦、腎細(xì)胞急性損傷。同時(shí),本研究對(duì)另一組復(fù)蘇動(dòng)物應(yīng)用貝科能進(jìn)行了治療,復(fù)蘇后24h采用透射電鏡觀察心、腦、腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)基本正常,核尚完整,少數(shù)細(xì)胞線粒體腫脹、空泡變性,損傷較常規(guī)復(fù)蘇組損傷為輕。同時(shí)對(duì)MDA含量、SOD、Na+-K+-ATPase活力進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)貝科能治療組心、腦、腎組織中MDA含量較常規(guī)復(fù)蘇組明顯下降,而作為體內(nèi)主要自由基清除系統(tǒng)的SOD活力較常規(guī)復(fù)蘇組顯著增高,Na+-K+-ATPase活力較常規(guī)復(fù)蘇組明顯增強(qiáng)。但貝科能治療組與對(duì)照組相比,仍有顯著差異。提示貝科能可減輕心肺復(fù)蘇后心、腦、腎細(xì)胞急性損傷。貝科能是由新鮮酵母中提取的含有輔酶Ⅰ(NAD)、腺三磷(ATP)、輔酶A(COA)、黃素核苷酸(FAD)、還原型谷光甘肽(GSH)、腺苷蛋氨酸(Ade-SD4)、核苷酸、1,6-二磷酸果糖(FDP)等多種輔酶及生命活性物質(zhì)組成的復(fù)合制劑,這些輔酶均為細(xì)胞物質(zhì)代謝和能量代謝所必需的。Kazuhiro等在研究聚乙烯一磷酸酰苷核糖合成酶預(yù)防心肌再灌流損傷時(shí)發(fā)現(xiàn),此酶可消耗細(xì)胞NAD+和ATP,導(dǎo)致細(xì)胞能量耗竭,而聚乙烯一磷酸酰苷核糖合成酶抑制劑可阻止NAD+消耗,在氧化應(yīng)激情況下保護(hù)心肌細(xì)胞并防止其調(diào)亡。缺血缺氧時(shí),糖酵解加強(qiáng),出現(xiàn)酸中毒,抑制磷酸果糖激酶活性,FDP可通過(guò)與細(xì)胞膜作用,增強(qiáng)磷酸果糖激酶活性,也可直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作為代謝底物,使ATP生成增多,保護(hù)正常細(xì)胞功能。同時(shí)FDP可穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜,有利于防治缺血