不同溫度貯藏對(duì)龍眼果皮褐變及相關(guān)酶活性的影響

龍眼是中國(guó)南方著名的水果。果實(shí)在7月至8月的高溫和炎熱季節(jié)成熟。收獲后，生理上產(chǎn)生了強(qiáng)烈的熱量。新鮮水果容易流失、棕櫚樹和腐爛，無(wú)法承受和儲(chǔ)存。大約一周后，所有腐敗和腐敗都在25c下。龍眼采后品質(zhì)劣變最為突出的問題是果皮褐變,嚴(yán)重的影響果實(shí)外觀品質(zhì)和商品價(jià)值,是限制龍眼長(zhǎng)期貯運(yùn)和遠(yuǎn)距離銷售的主要因素。近年來(lái)的研究認(rèn)為,龍眼果實(shí)采后褐變主要由多酚氧化酶(PPO)催化氧化內(nèi)源酚類底物、形成褐色物質(zhì)所引起。目前,雖然對(duì)龍眼果實(shí)采后酶促褐變機(jī)理的研究已有報(bào)道,但就不同品種龍眼褐變底物含量的差異等方面的了解還有欠缺,對(duì)這方面需要進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。因此,本研究以廣西主栽品種“石硤”,“儲(chǔ)良”和“大烏圓”為試材,探討果實(shí)在貯藏期間褐變底物水平與果實(shí)采后褐變的關(guān)系,旨在闡明果實(shí)的褐變度與主要褐變底物含量間的關(guān)系,為控制龍眼果皮褐變提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。1材料和方法1.1保鮮、貯藏龍眼品種石硤、儲(chǔ)良和大烏圓果實(shí)于2010年8月采自南寧市明陽(yáng)果園,果實(shí)采后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,選取大小、成熟度一致,無(wú)病蟲害的果實(shí),用1%施保克浸泡3min后,在室溫條件下晾干2h,裝入0.03mm厚的聚乙烯袋(每袋20個(gè)果,每個(gè)品種各裝15袋),低溫(2～4℃)貯藏4周,每隔1周取樣1次,每次3袋,分別去掉果肉,收集果皮。果皮用液氮速凍,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?.2褐變指數(shù)的計(jì)算果實(shí)的果皮褐變程度評(píng)估參照J(rèn)iang和Li(2001)及Zhang(2005)的方法,以不少于30個(gè)果實(shí)用于計(jì)算褐變指數(shù)。褐變指數(shù)=∑(褐變級(jí)數(shù)×果數(shù))/總果數(shù)。其中褐變級(jí)數(shù)分為5級(jí):1級(jí)果皮表面無(wú)褐變;2級(jí)果皮表面有輕微褐變;3級(jí)果皮表面積有25%以下發(fā)生褐變;4級(jí)果皮表面積有25%～50%發(fā)生褐變;5級(jí)果皮表面積有50%以上發(fā)生褐變。1.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備在4℃下分別取不同品種果皮5g,液氮冷凍后粉碎,加入200mL50%的乙醇提取12h,提取液用0.45μm濾膜過濾,濾液進(jìn)HPLC檢測(cè)。HPLC分離條件為:色譜柱為HypersilODS2柱(250mm×4.6mm,5μm,大連依利特);進(jìn)樣體積10μl;梯度洗脫,流動(dòng)相分別為0.4%的甲酸和100%甲醇,具體配比條件見表1;流速1mL/min,柱溫30,測(cè)定波長(zhǎng)280nm。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸20mg,置10mL容量瓶中,用提取底物的溶劑定容至刻度,使母液濃度為2.0mg/mL。將母液分別稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的梯度溶液,注入高效液相色譜儀中測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),色譜峰高度為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸分析。1.4酶活性測(cè)定1.4.1酶活的測(cè)定PPO的提取參照J(rèn)iang(2000)的方法,略有修改。取2g果皮,加入液氮磨成粉末,再加入5倍(w/v)量的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.8),內(nèi)含0.1%PVP(w/v)和0.1%TritonX-100(v/v),冰浴20min;在4℃下10000×g離心15min,上清液用于酶活性測(cè)定。在3mL反應(yīng)液中含有2.8mL10mmol/L鄰苯二酚(用pH6.8的0.01mol/L磷酸鈉緩沖液配制)和0.2mL酶液。加入酶液后,立即測(cè)定1min內(nèi)400nm處光吸收值的變化,以每分鐘OD400變化0.001表示一個(gè)酶活力單位。1.4.2酶活的測(cè)定POD的提取參照陳貽竹和王以柔(1989)的方法,略有修改。取2g果皮,用液氮冷凍后研磨粉碎,加入5倍(w/v)量的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.8),內(nèi)含0.1%PVP(w/v)和0.1%TritonX-100(v/v),冰浴20min;在4℃下10000×g離心15min,上清液用于酶活性測(cè)定。3mL反應(yīng)液中含有0.1mL4%愈創(chuàng)木酚、0.1mL0.46%過氧化氫、2.7mL磷酸鈉緩沖液(pH6.8)和0.1mL酶液。加入酶液后,立即測(cè)定2min內(nèi)470nm處光吸收值的變化,以每分鐘OD470變化0.01表示一個(gè)酶活力單位。2結(jié)果與分析2.1大烏圓貯藏期間不同品種褐變的變化從圖1可看出,在貯藏前期三個(gè)龍眼品種的褐變指數(shù)趨于近似,儲(chǔ)良較慢,石硤和大烏圓基本相同。在貯藏14～28d期間,儲(chǔ)良和大烏圓褐變指數(shù)迅速上升,在21d時(shí)95%的果實(shí)達(dá)到4級(jí)褐變,28d后兩個(gè)品種完全褐變。石峽與二者相比呈直線上升,褐變速度也很快,在貯藏28d后,褐變?nèi)窟_(dá)到4級(jí)。2.2周后儲(chǔ)良果皮中沒食子酸和柯拉京含量的變化從圖2可以看出,沒食子酸和柯里拉京在采后0d時(shí)較高,但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),三個(gè)龍眼品種的果皮中沒食子酸隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈直線下降,柯里拉京在采用1周內(nèi)驟減,2～4周緩慢下降,4周后大烏圓、石硤和儲(chǔ)良果皮中的沒食子酸相對(duì)于采收時(shí)的含量分別減少了74.76%、10.63%和63.37%,柯里拉京相對(duì)于采收時(shí)的含量變化分別為34.05%、58.41%和85.75%,其變化前后的具體含量見表2。鞣花酸的含量在貯藏期間變化規(guī)律不明顯,在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)鞣花酸不溶于磷酸鈉緩沖液,溶于氫氧化鈉溶液,龍眼果皮中的酶在pH6.8左右是活力最高的時(shí)候,在堿性環(huán)境基本失去活性,鞣花酸溶于堿液而不溶于緩沖液,因此初步判斷鞣花酸不是這3個(gè)龍眼品種果皮酶促褐變的底物。2.3不同采收期對(duì)ppo活性的影響圖3表明,石硤、儲(chǔ)良和大烏圓3個(gè)龍眼品種果皮內(nèi)PPO活性在一周內(nèi)快速提高,達(dá)到最高點(diǎn),采后1周PPO活性相對(duì)于采后0d時(shí)的變化量分別是156.35%、111.45%和163.49%,大烏圓和石硤的PPO活性變化趨勢(shì)近似,都是在第1周快速升高,在采后2～4周內(nèi)呈下降趨勢(shì),但仍維持在較高的活性水平上。相對(duì)于大烏圓和石硤的驟升和驟減,儲(chǔ)良的變化比較平緩且活性較低,4周后酶活基本消失。2.4不同采收期對(duì)磷系果皮pod活性的影響圖4表明,POD活性變化與PPO不同,大烏圓和石硤的果皮POD活性在第1周迅速上升,持續(xù)1周后迅速下降;儲(chǔ)良的果皮POD活性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)變化緩慢,采后1周石硤、儲(chǔ)良和大烏圓的PPO活性相對(duì)于采后0d時(shí)的變化量分別是156.35%、111.45%和163.49%。在貯藏過程中大烏圓和石硤的POD活變化趨勢(shì)基本一致,而儲(chǔ)良的酶活變化不大,4周后酶活相對(duì)于0d時(shí)的變化量為102.21%。3冷馬克思恩格斯對(duì)藥物代謝的影響酶、底物和氧氣是果實(shí)酶促褐變的三個(gè)必備條件,正常情況下,由于酶和底物在細(xì)胞中的區(qū)域化分布限制了酶促反應(yīng),果實(shí)不會(huì)發(fā)生褐變。植物器官或組織的酚類物質(zhì)在酶的作用下氧化為醌和水,醌再經(jīng)非酶促聚合,形成褐色物質(zhì)而產(chǎn)生褐變,即酶促褐變。龍眼果皮中的過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)也參與酚類物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化,與果實(shí)褐變密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,龍眼果皮中含有較高的POD和PPO活性,并隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),酶活性先增加后減小,PPO、POD可直接或間接催化底物的氧化聚合,引起果皮中褐變底物含量的降低。當(dāng)主要褐變底物的相對(duì)含量持續(xù)降低時(shí),表觀表現(xiàn)為龍眼果皮褐變度增加。冷藏條件下龍眼果皮的褐變度與主要褐變底物的變化和POD、PPO活性的變化相一致,且PPO、POD活性高的龍眼品種果實(shí)易出現(xiàn)褐變。不同品