熒光假單胞菌工程菌株的構(gòu)建摘要:采用基因工程的方法，將含有2,4DAPG基因的質(zhì)粒pMON5122導(dǎo)入到野生型熒光假單胞菌株中，探索了不同熱激時(shí)間、不同CaCl2濃度和熒光假單胞菌的不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化子形成的影響；結(jié)果表明,熒光假單胞菌生長(zhǎng)到OD約0.53時(shí)，用0.025mol/LCaCl2處理細(xì)胞,熱激3~4min,轉(zhuǎn)化頻率最高；關(guān)鍵詞:熒光假單胞菌；工程菌株；代謝產(chǎn)物;生物農(nóng)藥熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是植物根圍和土壤中常見的一種有益細(xì)菌,分布廣泛，易于繁殖。對(duì)植物病害,尤其是土傳病害如猝倒?。?］、根腐?。?］、枯萎?。?］等均有很好的防治作用,是重要的有益微生物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有非常重要的意義。利用熒光假單胞菌防治植物病害的機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)鐵元素和其他營養(yǎng)物質(zhì)、生態(tài)位排斥作用(Nicheexclusion)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，以及產(chǎn)生拮抗微生物的代謝產(chǎn)物等?？股饔靡恢币詠矶急徽J(rèn)為是假單胞菌類生防作用的重要方面。2,4DAPG是熒光假單胞菌產(chǎn)生的一種具有抗真菌、抗細(xì)菌作用的酚類代謝產(chǎn)物,在抑制多種土傳植物病害中占有重要地位,如它對(duì)防治由小麥全蝕病菌引起的小麥全蝕病起著重要作用。為提高生防效果，擴(kuò)大生防范圍，更加有效地防治蔬菜等某些土傳病害,我們進(jìn)行了熒光假單胞菌工程菌株的構(gòu)建。試圖通過增加DAPG合成基因拷貝數(shù)的途徑，來提高菌株的生防效果。工程菌株對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果超過了野生菌株，為進(jìn)一步研究一種新型、高效的生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。材料和方法培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g,蒸餾水1000mL,pH7.5。選擇培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中加入四環(huán)素至終濃度25pg/mL。沙-玉米粉培養(yǎng)基:沙98份,玉米粉2份，水少許。質(zhì)粒的提取、純化和檢測(cè)采用堿裂解法提取質(zhì)粒，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。熒光假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞的制備將熒光假單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28°C振蕩培養(yǎng)過夜，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于10mL新鮮的LB培養(yǎng)液中，于28C,240r/min振蕩培養(yǎng)至OD約0.53,冰浴30min,離心收集菌體，加入5mL預(yù)冷的0.025mol/LCaCl2處理2h,離心，菌體用1mL預(yù)冷的0.025mol/L的CaCl2懸浮備用。轉(zhuǎn)化反應(yīng)將1?2pL（約川g）pMON5122質(zhì)粒DNA與200pL感受態(tài)細(xì)胞混勻,冰浴放置30min,42C熱激3min,冰浴中放置5min,加入800pLLB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)1h,按每皿100pL涂布于含四環(huán)素的平板上,28C培養(yǎng)約40h,挑取抗性菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化條件研究在以上方法的基礎(chǔ)上，分別改變CaCl2濃度、熱激時(shí)間和熒光假單胞菌生長(zhǎng)時(shí)期研究不同條件對(duì)轉(zhuǎn)化子形成的影響。結(jié)果與分析工程菌的構(gòu)建及鑒定工程菌株的構(gòu)建策略，將PMON5122質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化方法克隆入熒光假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)克隆子的四環(huán)素抗性篩選出在四環(huán)素平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。提取陽性重組子中的質(zhì)粒PMON5122，用HindIII和EcoRI進(jìn)行雙酶切后，產(chǎn)生2個(gè)片斷，大小分別為1015kb（與載體PRK415大小相同）和6.5kb,其中的小片段為DAPG合成基因表明DAPG合成基因已經(jīng)導(dǎo)入熒光假單胞菌野生菌株中。CaCl2濃度對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響Ca2+在低溫時(shí)可以使細(xì)胞壁的通透性及細(xì)胞表面的正電荷增加，這些改變有利于DNA的吸附和吸收。本試驗(yàn)用不同濃度的CaCl2即0.020,0.025,0.030和0.040mol/L處理熒光假單胞菌細(xì)胞，結(jié)果表明,用0.025mol/LCaCl2處理熒光假單胞菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率最高,0.040mol/LCaCl2處理轉(zhuǎn)化頻率最低，隨著CaCl2濃度的提高，轉(zhuǎn)化頻率呈現(xiàn)升高一降低的變化趨勢(shì)，濃度超過0.025mol/L時(shí),轉(zhuǎn)化頻率急速下降。熱激時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響本試驗(yàn)在42°C時(shí)分別處理1,2,3,4min,目的在于促進(jìn)熒光假單胞菌對(duì)DNA的吸收，熱激時(shí)間直接影響轉(zhuǎn)化子的形成，結(jié)果表明，處理1,2min時(shí)，沒有轉(zhuǎn)化子形成，處理3,4min時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率較高.生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響細(xì)菌的生長(zhǎng)時(shí)期直接影響感受態(tài)細(xì)胞的建立。取不同生長(zhǎng)時(shí)期的熒光假單胞菌，用0.025mol/LCaCl2處理進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，在OD約0.53時(shí),轉(zhuǎn)化頻率最高,OD大于或小于0.53時(shí),轉(zhuǎn)化頻率均表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。五、討論大多數(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法都依據(jù)Mandel和Higa在1970年的發(fā)現(xiàn)[9],首先用冰預(yù)冷的CaCl2溶液處理細(xì)菌然后作短暫的熱處理，該處理方法改變了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),在受體細(xì)胞中誘導(dǎo)了一種短暫的“感受態(tài)”，使質(zhì)粒DNA能夠穿過細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，因此,CaCl2的濃度和熱處理時(shí)間對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，通常CaCl2濃度為011mol/L,42°C熱激90s。但在本試驗(yàn)中，當(dāng)CaCl2濃度為0.025mol/L,42°C熱激3min時(shí),轉(zhuǎn)化頻率最高。微生物對(duì)病原菌具有抑制