多重PCR法在食品中致瀉大腸埃希氏菌質(zhì)控考核中的應(yīng)用

Summary：目的通過多重PCR方法檢測質(zhì)控樣本中致瀉性大腸埃希氏菌方法：參照GB4789.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗(yàn)》進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果編號(hào)15-1樣品檢出EHEC，15-2樣品檢出ETEC。本實(shí)驗(yàn)室順利完成考核，結(jié)果與考核方一致。結(jié)論：多重PCR法在質(zhì)控考核中，能夠?qū)δ繕?biāo)菌快速鑒別，能夠快速順利完成質(zhì)控考核，同時(shí)了解該實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰蛯?shí)驗(yàn)室質(zhì)控水平，提高檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和有效性，保證實(shí)驗(yàn)室的檢測水平。Key：質(zhì)控考核；致瀉大腸埃希氏菌；多重PCR1.引言大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌，是人類和動(dòng)物的腸道中重要的正常菌群，為宿主提供一些有營養(yǎng)作用的合成代謝產(chǎn)物。多數(shù)大腸埃希氏菌并不致病，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件致病菌而引起腸道外的感染，引起胃腸炎的大腸埃希氏菌分為五類即腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）和粘附性腸埃希氏菌（EAEC）[1]?？焖贆z測和鑒定病原菌是及時(shí)有效地控制與預(yù)防傳染病傳播的重要手段。傳統(tǒng)的微生物學(xué)分離與鑒定以及血清學(xué)方法在鑒別與鑒定病原微生物方面日益顯現(xiàn)出不足。PCR法快速、敏感、特異，是對病原菌快速鑒別與分型的重要技術(shù)之一，而多重PCR更以其突出的優(yōu)越性得到了廣泛的應(yīng)用[2]。2.材料與方法2.1樣品樣品編號(hào)為15-1，15-2，每份考核樣品包含西林瓶1個(gè)，西林瓶中裝有白色凍干菌球。本次考核共計(jì)2份樣品。2.2試劑及儀器營養(yǎng)肉湯、腸道菌增菌肉湯、麥康凱瓊脂（MAC）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、三糖鐵（TSI）瓊脂、大腸埃希氏菌生化套盒、無菌雙蒸水，以上試劑均使用北京路橋。五種致瀉大腸埃希氏菌DNA提取試劑盒、多重PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒均使用北京卓誠惠生，實(shí)時(shí)定量PCR儀器（BIO-RAD公司），凝膠成像儀（BIO-RAD公司），電泳儀。2.3試驗(yàn)方法按照GB4789.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》[2]開始檢測。2.3.1樣品前處理與預(yù)增菌待質(zhì)控樣品恢復(fù)至室溫，無菌開啟瓶蓋，將西林瓶中的白色菌球完全溶解于50mL無菌生理鹽水中，作為樣本。2.3.2以無菌操作量取檢樣25mL，加入裝有225mL營養(yǎng)肉湯的無菌袋中，振蕩混勻。將營養(yǎng)肉湯增菌液放置于36℃培養(yǎng)18h（增菌時(shí)間延長）。取1mL（加樣量增大），接種于30mL腸道菌增菌肉湯管內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18h。2.3.3分離將增菌液劃線接種MAC和EMB瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)24h，觀察菌落特征。2.3.4生化鑒定選取平板上10個(gè)可疑菌落，分別接種TSI斜面。同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、尿素瓊脂（pH7.2）、KCN肉湯和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)24h。2.3.5PCR確證試驗(yàn)使用1μL接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落，懸浮于200μL滅菌雙蒸水中，充分打散制成菌懸液，13000r/min離心3min，棄掉上清液。加入50μL充分震蕩混勻的核酸提取液，于100℃金屬浴維持10min，13000r/min離心3min，收集上清液，取2μL作為PCR檢測的模板。3.結(jié)果與分析3.1平板分離結(jié)果結(jié)果如下3.2可疑菌落生化鑒定結(jié)果如下3.3可疑菌落PCR確證試驗(yàn)結(jié)果如下4.討論與分析本實(shí)驗(yàn)室自2014起，參與國家食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測項(xiàng)目，并開始使用多重PCR技術(shù)，對五種致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測。GB4789.6-2016自2017年6月23日執(zhí)行以來，也是食品微生物學(xué)檢驗(yàn)系列國標(biāo)中，首個(gè)細(xì)菌使用PCR做確證的標(biāo)準(zhǔn)。河南省疾病預(yù)防控制中心對全省各地市進(jìn)行了質(zhì)控考核，了解各實(shí)驗(yàn)室對該技術(shù)掌握的程度以及實(shí)驗(yàn)室檢測水平。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型，操作繁瑣，技術(shù)人員要求高，且檢驗(yàn)結(jié)果并不能作為是否有致病能力的依據(jù)，只能說某個(gè)血清型可能與致病相關(guān)。血清學(xué)鑒定的137株致瀉大腸中僅有15株（10.9%）為正確鑒定，僅采用血清學(xué)分類是不夠的[3]。與傳統(tǒng)血清試驗(yàn)相比較而言，用PCR方法進(jìn)行確證，操作簡單，對操作人員要求不高，且提高致病菌檢出率及檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，同時(shí)縮短了致病菌的檢驗(yàn)時(shí)間。隨著快速檢驗(yàn)方法的發(fā)展，快速檢驗(yàn)因其優(yōu)點(diǎn)快速發(fā)展，在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處理中，發(fā)揮積極作用，但快速方法也存在其缺點(diǎn)，快速檢驗(yàn)一般從基因著手，檢測到致病菌并未獲得其菌株，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，在面對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，應(yīng)該靈活運(yùn)用，將快檢方法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合，快速準(zhǔn)確地得出實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，為相關(guān)部門處理問題提供可靠依據(jù)。該實(shí)驗(yàn)室在此質(zhì)控過程中使用了兩種多重PCR方法來進(jìn)行確證試驗(yàn)，相互印證結(jié)果，兩種方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)時(shí)熒光多重PCR優(yōu)點(diǎn)在于將PCR擴(kuò)增與結(jié)果判定結(jié)合一起，操作簡單，耗時(shí)短，污染少。普通PCR試驗(yàn)后，需要進(jìn)行電泳試驗(yàn)并用凝膠成像儀觀察結(jié)果，操作繁瑣，試驗(yàn)過程耗時(shí)長，存在污染環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[4]。Reference[1]李凡，劉晶星.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)（第七版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012.[2]世界衛(wèi)生組織.麻疹實(shí)況報(bào)道.2017-03.[3]GB4789.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗(yàn)》[s].[4]JYang，F(xiàn)JWu，JMu，LLin，etal.ComparisonbetweenOSerotypingMethodandMultiplexReal-TimePCRToIdentifyDiarrheagenicEscherichiacoliinTaiWan[J].《JournalofClinicalMicrobiology》，2007，45（11）：3620-3625史曉娟魏紅霞新鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心賀?；ㄐ锣l(xiāng)市結(jié)核病防治所食品安全導(dǎo)刊·中旬