蛇莓對(duì)人結(jié)腸癌rko細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)及失巢凋亡作用

血液或淋巴氏組的移動(dòng)是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要生物過程。上皮來源腫瘤細(xì)胞在血液或淋巴循環(huán)中存活與失巢凋亡(Anoikis)相關(guān)。失巢凋亡現(xiàn)象由Frish等于1994年首次發(fā)現(xiàn)。上皮類細(xì)胞依賴基質(zhì)黏附提供存活信號(hào),脫離基質(zhì)黏附將發(fā)生凋亡,即失巢凋亡。腫瘤細(xì)胞由于基因表達(dá)或活性異常而獲得一定程度的失巢凋亡耐受,使得部分腫瘤細(xì)胞可以在血液或淋巴循環(huán)中存活,最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。在適當(dāng)?shù)乃幬镏委熛?腫瘤細(xì)胞可以發(fā)生失巢凋亡,失巢凋亡已成為腫瘤治療新的靶標(biāo)。本研究在結(jié)腸癌細(xì)胞中觀察了蛇莓對(duì)RKO結(jié)腸癌細(xì)胞失巢凋亡的作用。材料和方法一、ell/assay和polehema細(xì)胞株與試劑:人結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫;CytoSelectTM24-WellAnoikisAssay為CellBiolabs產(chǎn)品;CellCountingKit-8(CCK-8)為Dojindo產(chǎn)品;polyHEMA購自SigmaAldrich公司;Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品;活性氧檢測(cè)試劑盒為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;中藥由龍華醫(yī)院中藥房提供并鑒定。二、實(shí)驗(yàn)方法1.粗心理液的制備參考文獻(xiàn)方法制備中藥,蛇莓300g加8倍量水,浸泡1h,煎煮2次,每次30min,收集中藥煎液紗布粗慮去渣,合并濾液、濃縮,18000rpm離心30min,取上清加入等體積無水乙醇,4℃過夜;18000rpm離心30min,取上清液冰凍干燥,稱重,RPMI1640溶解,調(diào)濃度至400mg·mL-1,依次0.45和0.22μm濾器過濾除菌,1mL分裝,4℃保存?zhèn)溆谩?.加入不同濃度中藥或等體積rpmi13401×104對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RKO細(xì)胞接種于poly-HEMA包被96孔板,接種后第2天加入不同濃度中藥或等體積RPMI1640,每組3個(gè)復(fù)孔;藥物作用24h后加入10μLCCK-8,37℃反應(yīng)2h,酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔OD值,按公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。3.加入不同濃度中藥或等體積rpmi13401×105對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RKO細(xì)胞接種于poly-HEMA包被24孔板,接種后第2天加入不同濃度中藥或等體積RPMI1640,每組3個(gè)復(fù)孔;藥物作用24h后加入1μLEthD-1,37℃反應(yīng)1h,熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(激發(fā)波長(zhǎng):525nm,發(fā)射波長(zhǎng):590nm),熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。4.不同濃度中藥或等體積rp-mi13401×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RKO細(xì)胞接種于poly-HEMA包被直徑6cm培養(yǎng)皿,接種后第2天加入不同濃度中藥或等體積RP-MI1640,每組3個(gè)樣本;藥物作用24h后收集細(xì)胞,按操作說明書采用酶底物法檢測(cè)Caspase-3活性。5.樣品處理低質(zhì)低效5×105對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RKO細(xì)胞接種于poly-HEMA包被6孔板,接種后第2天加入不同濃度中藥或等體積RPMI1640,空白組不作處理,每組3個(gè)樣本;藥物作用24h后收獲細(xì)胞,加入含DCFH-DA探針(10μmol·L-1)的無血清RP-MI1640,37℃孵育20min,熒光酶標(biāo)儀測(cè)各孔OD值(激發(fā)波長(zhǎng):488nm,發(fā)射波長(zhǎng):525nm)。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法組間比較為均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差時(shí),兩組間差異主要采用lsd法,以p>0.05為5.采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異比較采用單向方差分析,組間兩兩比較用LSD法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.蛇莓對(duì)rko細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的影響本研究采用poly-HEMA包被造模,促使RKO細(xì)胞懸浮生長(zhǎng),結(jié)果顯示200~600μg·mL-1蛇莓可以顯著抑制RKO細(xì)胞懸浮生長(zhǎng),與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),結(jié)果見表1。2.蛇莓不同劑量對(duì)rko細(xì)胞熒光染色的影響研究采用CytoS-electTM24-WellAnoikisAssay試劑盒,以EthD-1熒光染色檢測(cè)失巢凋亡,結(jié)果顯示蛇莓作用后RKO細(xì)胞可以吸收EthD-1呈現(xiàn)紅色熒光,部分細(xì)胞可見核碎裂,結(jié)果見圖1;蛇莓不同劑量組熒光光密度與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),結(jié)果見表2;提示蛇莓可以促RKO細(xì)胞失巢凋亡。3.蛇莓葉片caspase-3活性研究采用酶底物反應(yīng)比色法檢測(cè)蛇莓對(duì)懸浮生長(zhǎng)RKO細(xì)胞Caspase-3活性影響,結(jié)果顯示200~600μg·mL-1蛇莓可以顯著增強(qiáng)懸浮生長(zhǎng)RKO細(xì)胞Caspase-3活性(P<0.01),結(jié)果見表3。4.蛇莓細(xì)胞內(nèi)ros含量研究采用DCFH-DA熒光染色法檢測(cè)活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平,結(jié)果顯示200~600μg·mL-1蛇莓可以顯著升高懸浮生長(zhǎng)RKO細(xì)胞內(nèi)ROS水平,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表4。蛇莓對(duì)rko細(xì)胞失巢凋亡作用蛇莓是薔薇科植物蛇莓Duchesneaindica(Andr.)Focke的全草,有清熱解毒、活血散瘀、收斂止血作用,中醫(yī)臨床常用于腫瘤的治療。研究發(fā)現(xiàn)蛇莓可以抑制卵巢癌、宮頸癌細(xì)胞增殖,提升細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2表達(dá)比例,促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放,活化Caspase-3,進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢癌、宮頸癌細(xì)胞凋亡;蛇莓同時(shí)還可抑制CyclinA、CyclinE、CyclinD1以及CDK2表達(dá),并阻滯卵巢癌、宮頸癌細(xì)胞周期于S期。蛇莓組分齊墩果酸還可以抑制肝癌細(xì)胞增殖。此外,有研究表明蛇莓可以抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成。目前尚缺乏蛇莓對(duì)腫瘤細(xì)胞失巢凋亡作用的研究。poly-HEMA是一種無毒陰離子聚合物,具有均勻的非離子特性,鋪在培養(yǎng)皿底部,可阻止細(xì)胞貼壁,使得細(xì)胞只能懸浮生長(zhǎng),poly-HEMA常用為失巢凋亡研究模型。本研究結(jié)果顯示蛇莓可以抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞在poly-HEMA包被板中的生長(zhǎng),提示蛇莓對(duì)懸浮生長(zhǎng)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞具有抗癌作用。EthD-1(Ethidiumhomodimer)是一種核酸熒光染料,EthD-1可以進(jìn)入破損細(xì)胞結(jié)合核酸,呈現(xiàn)紅色熒光信號(hào),但不能滲透活細(xì)胞,因此常用作死亡細(xì)胞的熒光染色指示劑;CytoSelectTM24-WellAnoikisAssay試劑盒以EthD-1為標(biāo)記,結(jié)合細(xì)胞在poly-HEMA包被板懸浮生長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)胞失巢凋亡。本研究EthD-1染色顯示蛇莓作用后RKO細(xì)胞可以吸收EthD-1呈現(xiàn)紅色熒光,部分細(xì)胞還可見核碎裂,提示蛇莓可以促使RKO細(xì)胞失巢凋亡。失巢凋亡是一種特殊形式的細(xì)胞凋亡,失巢凋亡也是由Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的。上皮細(xì)胞與胞外基質(zhì)黏附后經(jīng)整合素介導(dǎo),形成粘著斑(Focaladhesionplaque),促使粘著斑激酶(Focaladhesionkinase,FAK)構(gòu)象變化而活化;FAK下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與MAPK、PI3K-AKT等信號(hào)通路有關(guān)。細(xì)胞脫離基質(zhì)黏附后FAK到MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制,致使細(xì)胞凋亡分子調(diào)控失常,活化Caspases。與細(xì)胞凋亡一樣,失巢凋亡也可以通過內(nèi)源或外源通路,分別活化Caspase-9或Caspase-8,進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白酶Caspase-3,引發(fā)失巢凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)蛇莓可以活化懸浮狀態(tài)RKO細(xì)胞Caspase-3,提示蛇莓對(duì)RKO細(xì)胞失巢凋亡作用與Caspase-3活性相關(guān)。ROS是細(xì)胞在有氧代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇,細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化可以引起腫瘤細(xì)胞一系列與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)信號(hào)通路的變化,提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平可活化細(xì)胞內(nèi)Caspases活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。ROS是中藥活化Caspase信號(hào)通路,介導(dǎo)抗癌作用的重要機(jī)制,已發(fā)現(xiàn)大黃素、姜黃素等中藥組分可以通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平