不同劑量致敏原對過敏性哮喘模型血清特異性抗體的影響

過敏哮喘由免疫球蛋白e（ige）診斷，由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和t淋巴結(jié)引起的過敏性疾病。研究表明,過敏性哮喘發(fā)作時,患者IgE水平顯著升高。有學(xué)者報道,不同劑量的過敏原會引發(fā)機體輔助性T細(xì)胞(Th)向Th1和Th2分化的不同趨勢,從而影響其臨床結(jié)局。本研究觀察不同劑量的致敏原對過敏性哮喘模型小鼠血清特異性抗體IgE、IgG2a和白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、γ-干擾素(IFN-γ)等炎性細(xì)胞因子的影響,現(xiàn)報告如下。1材料和方法1.1實驗動物中心雌性BALB小鼠45只,8周齡,體質(zhì)量20~25g,平均(22.36±1.08)g,均購自山東省實驗動物中心。45只小鼠隨機分為4組:空白對照組10只,低劑量組12只,中劑量組11只,高劑量組12只。1.2血清及緩沖液試劑超聲霧化器購自上海四菱醫(yī)療器械廠,雞卵蛋白(OVA)購自美國Sigma公司,胎牛血清(FBS)及PBS緩沖液均購自武漢博士德生物工程有限公司,ELISA試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.3不同劑量ova的單次注射分別將10、100、1000μg的OVA溶于含40mg氫氧化鋁、pH值7.4的200μLPBS緩沖液中,各組于第0、7、14天分別進(jìn)行腹腔注射:空白對照組注射不含OVA的PBS緩沖液200μL,其余3組分別注射上述含不同劑量OVA的PBS緩沖液200μL。第15~20天內(nèi)將小鼠置于霧化吸入箱內(nèi)進(jìn)行霧化激發(fā)致敏,通過超聲霧化發(fā)生器霧化吸入5%的OVA生理鹽水溶液,20min/(次·d),共處理6d。小鼠出現(xiàn)呼吸急促、口唇紫疳、煩躁不安、行動遲緩、腹肌痙攣及大小便失禁等癥狀即為造模成功。1.4檢測方法1.4.1特異性抗體檢測最后一次霧化激發(fā)致敏24h后,取各組小鼠眼內(nèi)眥靜脈血,離心后取血清,以ELISA試劑盒檢測特異性抗體IgE、IgG2a含量。1.4.2各組小鼠細(xì)胞的生長取血后處死小鼠,取出脾臟,在金屬網(wǎng)上磨碎,離心后取細(xì)胞沉淀,懸于加有10%FBS的RPMI培養(yǎng)液(100aU/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素)中制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),每只小鼠細(xì)胞培養(yǎng)2孔,1孔加入200mg/L的OVA,1孔設(shè)為空白對照。細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中37℃培養(yǎng)24h后,收集上清液置于-80℃冰箱保存待測,以ELISA法檢測血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ的含量。1.4.3肺組織病理學(xué)樣本的制作小鼠處死后取右肺門至邊緣處3mm厚度的組織標(biāo)本,以15%甲醛固定,石蠟包埋切片后,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。1.5觀察指標(biāo)觀察各組小鼠肺組織病理變化、血清特異性抗體IgE、IgG2a水平及血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ水平差異。2結(jié)果2.1低劑量組的病理組織學(xué)觀察空白對照組肺組織無明顯炎細(xì)胞浸潤,各給藥組均出現(xiàn)不同程度炎細(xì)胞浸潤,低劑量組最為顯著,鏡下可見上皮細(xì)胞斷裂或脫落,杯狀細(xì)胞增生,血管壁水腫,支氣管壁增厚,周圍見大量以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤。中、高劑量組炎癥反應(yīng)依次減輕。見圖1。2.2兩組患者不同時點證試驗及顯著比較見表1低、中、高劑量組IgE水平呈遞減趨勢,組間差異顯著(P<0.01),且均顯著高于對照組(P<0.01);各實驗組血清IgG2a水平呈遞增趨勢,組間差異顯著(P<0.01),且均顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)。見表1。2.3兩組患者,總總p對比,2組低、中、高劑量組血清IL-4、IL-5水平呈遞減趨勢,組間差異顯著(P<0.01),且均顯著高于對照組(P<0.01);各實驗組血清IL-12及IFN-γ水平呈遞增趨勢,組間差異顯著(P<0.01),且均顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)。見表2。3模型小鼠血清中th2細(xì)胞、th1和ige含量的變化最早、最經(jīng)典的過敏性哮喘動物模型是通過豚鼠制備,但由于相應(yīng)檢測試劑較為缺乏,限制了其廣泛應(yīng)用,而小鼠試劑來源廣泛,實驗費用相對低廉,近年來逐步地應(yīng)用于建立哮喘模型。過敏性哮喘是一種以多種炎癥細(xì)胞和/或細(xì)胞因子浸潤、IgE升高、肺部組織結(jié)構(gòu)重塑以及氣道反應(yīng)性增高為特征的慢性氣道炎癥,屬于IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)。當(dāng)致敏原進(jìn)入機體,CD4+Th2細(xì)胞和B細(xì)胞被激活,產(chǎn)生特異性IgE,后者與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞結(jié)合,使機體處于致敏狀態(tài);當(dāng)相同的致敏原再次激發(fā)時,肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞就會釋放大量炎性介質(zhì),誘發(fā)機體生理功能紊亂,疾病發(fā)作。目前認(rèn)為,Th1/Th2細(xì)胞平衡紊亂,Th1細(xì)胞朝向Th2細(xì)胞分化,IgE含量增加是過敏性哮喘發(fā)作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5等多種細(xì)胞因子,而IL-4可誘導(dǎo)B細(xì)胞的Ig類別轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致IgE增加,IgE既能啟動速發(fā)相過敏反應(yīng),也可誘發(fā)遲發(fā)相過敏反應(yīng),對過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用;IL-5則具有趨化嗜酸性粒細(xì)胞聚集的作用,而嗜酸性粒細(xì)胞是參與炎癥浸潤的主要效應(yīng)細(xì)胞,可加速氣道組織結(jié)構(gòu)的破壞,這些炎癥細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子共同引發(fā)或促進(jìn)呼吸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。Th2細(xì)胞則可分泌IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子,抑制Th2型細(xì)胞因子的促炎作用,抑制致敏原引發(fā)的過敏作用。成功的免疫治療可有效降低IgE水平,誘導(dǎo)B細(xì)胞在合成免疫球蛋白時由IgE向IgG轉(zhuǎn)化,而IgG作為抗體可捕獲抗原,與之形成抗原-抗體復(fù)合物,從而緩解過敏癥狀。當(dāng)小鼠在致敏原作用下出現(xiàn)Th2細(xì)胞占優(yōu)勢,IgE含量增加,而Th1型細(xì)胞因子含量降低的趨勢時,就會表現(xiàn)出過敏性哮喘表型,即造模成功。盡管個體暴露于致敏原下是過敏性哮喘發(fā)作的始動環(huán)節(jié),但研究發(fā)現(xiàn)對過敏性患者重復(fù)給予大濃度致敏原的免疫治療可能誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫耐受,患者體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平下降,從而實現(xiàn)哮喘逆轉(zhuǎn)。因此,掌握恰當(dāng)?shù)闹旅粼瓭舛纫源_保小鼠模型能真實表現(xiàn)出過敏性哮喘的臨床特征,又不致產(chǎn)生免疫耐受是建立哮喘模型的關(guān)鍵問題。商艷等采用不同劑量的OVA致敏激發(fā)小鼠,制備過敏性哮喘模型,結(jié)果表明,低劑量組(10μgOVA)小鼠肺部炎癥表現(xiàn)最明顯,支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞含量及血清IgE水平顯著高于對照組及其他各劑量組。湛孝東等采用7種不同濃度的致敏原制備小鼠模型,結(jié)果表明,低濃度OVA連續(xù)致敏的小鼠肺部病理改變最為顯著,高濃度OVA造模的效果較差。本研究結(jié)果表明,低劑量組小鼠的肺組織炎細(xì)胞浸潤最明顯,且血清IgE、IL-4、IL-5水平顯著高于對