轉(zhuǎn)基因細(xì)胞構(gòu)建方案一：?jiǎn)蚊盖?、 G2A（1400多bp）連在老師從日本帶回的載體，配LB培養(yǎng)基擴(kuò)培菌株（含G2A）（注:用含Amp的培養(yǎng)基擴(kuò)培。菌株應(yīng)該在一樓-80度冰箱，有個(gè)盒子上面寫的我的名字）。2、 提質(zhì)粒、酶切（EcoR!）鑒定，膠回收。3、 酶切含報(bào)告基因的載體（EcoR!）并鑒定，膠回收。4、 用BAP處理酶切后的載體：DNA40pl10xbuffer5g1BAP2g1ddH2O3g1total50g165°C反應(yīng)30min，補(bǔ)ddH2O至200gl加酚：氯仿：異戊醇（體積比25：24：1）200^1振蕩（抽提蛋白），13000rpm離心5min吸上清（體系分兩層，DNA在上層水相）（可重復(fù)一次）加入與吸取上清等體積的氯仿：異戊醇（體積比24：1）振蕩，13000rpm離心5min吸上清。加入十分之一體積3MpH5.2的醋酸鈉（4度冰箱中有）混勻。（鈉離子利于DNA沉淀）加入2.5倍體積-20C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，立即混勻。（局部高濃度的乙醇會(huì)使DNA斷裂）-20C沉淀30-60min。4度13000rpm離心15min棄溶液留沉淀，用500^1預(yù)冷的70%乙醇洗一次4度13000rpm離心10min空氣干燥去乙醇，加30g1ddH2O回溶可以跑電泳看DNA含量情況5、連接G2A片段20-100ng（2g1左右）載體片段（BAP處理）10g110xbuffer2g1T4DNA連接酶0.2^1ddH2O補(bǔ)至20g1total20g116度連接過(guò)夜6、 轉(zhuǎn)化、涂板（含抗生素）、挑菌、擴(kuò)培（含抗生素）、提質(zhì)粒、酶切鑒定7、 若連接成功還得驗(yàn)證是正連還是反連，方法問(wèn)師兄8、 構(gòu)建好的重組子要測(cè)濃度（問(wèn)基因工程實(shí)驗(yàn)室的人）9、 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞10、 轉(zhuǎn)染方法：用Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞培養(yǎng)（以六孔板為例，其它培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿參考六孔板進(jìn)行操作）：在轉(zhuǎn)染前一天（20-24小時(shí)）把約20-60萬(wàn)細(xì)胞（具體的細(xì)胞數(shù)量據(jù)細(xì)胞大小和細(xì)胞生長(zhǎng)速度而定）培養(yǎng)到六孔板內(nèi)，使第二天細(xì)胞能達(dá)到約70-80%滿。在進(jìn)行下述轉(zhuǎn)染步驟前，把六孔板每孔內(nèi)換成新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的體積約為2ml，可以含有血清和抗生素。把Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻。參考下表，對(duì)于待轉(zhuǎn)染的六孔板中一個(gè)孔的細(xì)胞，在一潔凈無(wú)菌離心管內(nèi)依次加入4glLipofecter,適量不含抗生素和glutamine的DMEM溶液，及1.5pgDNA，使最終體積為70皿，用槍輕輕吹打混勻。注意：不可Vortex或離心。Onewellfor6-wellOnewellfor12-wellOnewellfor24-well60mmdishLipofecter4gl2gl1gl8glDMEM(66-x)gl(33-x)pl(17-x)gl(132-x)glDNAxgl(1.5gg)xgl(0.8gg)xgl(0.4gg)xgl(3gg)Finalvolume70pl35gl18pl140pl注1：對(duì)于六孔板中一個(gè)孔的細(xì)胞，Lipofecter的用量可以在2-6pl內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，DNA用量可以在1-3哽的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。最佳的轉(zhuǎn)染條件，因具體的細(xì)胞和培養(yǎng)條件而定，可以在上述推薦范圍內(nèi)自行優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。對(duì)于多個(gè)孔轉(zhuǎn)染相同數(shù)量相同質(zhì)粒的情況可以把每個(gè)孔所需的Lipofecter和DNA混合物配置在一個(gè)離心管內(nèi)，后續(xù)混勻孵育等步驟后可以分加到各個(gè)孔內(nèi)。注2：對(duì)于其它培養(yǎng)板或培養(yǎng)器皿，各種試劑的用量可以按照細(xì)胞培養(yǎng)面積按比例進(jìn)行換算。如果轉(zhuǎn)染RNA或寡核苷酸等可以參考轉(zhuǎn)染DNA的條件進(jìn)行。注3：轉(zhuǎn)染siRNA或其它類似的數(shù)十個(gè)堿基對(duì)雙鏈核酸可以參考下表進(jìn)行:ForsiRNAOnewellfor6-wellDMEM(67-x)glLipofecter3glDNAxgl(1gg)Finalvolume70gl⑤15-25°C孵育15分鐘（超凈臺(tái)內(nèi)即可）。有可能出現(xiàn)絮狀沉淀物，屬正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。無(wú)論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，均把70glLipofecter-DNA混合物全部加入六孔板的一個(gè)孔內(nèi)。加入時(shí)注意盡量均勻加入到整個(gè)孔內(nèi)，隨后輕輕混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5-6小時(shí)后，吸除含有Lipofecter-DNA的培養(yǎng)液。每孔加入2ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。注：轉(zhuǎn)染后5-6小時(shí)不更換細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)大多數(shù)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，更換培養(yǎng)液對(duì)一些細(xì)胞可以提高轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于基因表達(dá)，再培養(yǎng)24-40小時(shí)后即可檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果；對(duì)于RNAi通常需要培養(yǎng)3-5天，并且期間需要更換培養(yǎng)液。如果用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，則在轉(zhuǎn)染后24-40小時(shí)即可加入適當(dāng)?shù)暮Y選藥物，例如G418等，進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。構(gòu)建好的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在特定光激發(fā)下會(huì)發(fā)出熒光，然后照相，凍存??！構(gòu)建好的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，先饑餓，然后各種刺激處理到時(shí)與老師討論。提蛋白（全程冰上操作）：融化細(xì)胞裂解液WIP（-20度保存）融化后1ml裂解液加10glPMSF（蛋白酶抑制劑）吸掉六孔板中的培養(yǎng)基，用PBS（預(yù)冷，-20度）沖洗三遍每孔加入200gl裂解液（裂解液的多少取決于細(xì)胞密度，細(xì)胞多加的多，細(xì)胞少加的少）冰上裂解10-15min，用細(xì)胞刮刮細(xì)胞將裂解液移入離心管，4度12000rpm離心5min，取上清測(cè)定蛋白濃度（酶標(biāo)儀）：BCA蛋白分析A液+B液=50:196孔板每孔200glBCA混合液+25gl蛋白樣品37度孵育30min酶標(biāo)儀預(yù)熱后測(cè)定在570nm處吸光度計(jì)算上樣蛋白體積：Y=937.93X-165.68（X為吸光度），然后以蛋白濃度最小的為標(biāo)準(zhǔn)，用C]V]=C2V2計(jì)算其他蛋白樣品體積，不夠的用裂解液補(bǔ)齊。Westernblot方案二：雙酶切G2A（1400多bp）連在老師從日本帶回的載體，配LB培養(yǎng)基擴(kuò)培菌株（含G2A）（注：用含Amp的培養(yǎng)基擴(kuò)培。菌株應(yīng)該在