包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。1．取材材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。（1）植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動物物殺死后迅速取出所需要的組織。（2）取材必須新鮮，這一點對于從事細胞生物學(xué)研究尤為重要，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液。（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。（4）切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。2．固定引起病理變化直至歸于死亡。為了使標(biāo)本能反映它生前的正常狀態(tài)，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，后的處理，還會改變細胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色。下來。及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內(nèi)含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固來加以選擇。19固定時，須注意以下幾點：（1）固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應(yīng)嚴加控制，不能過長。（5）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合。（6）固定完畢，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色。3．脫水脫水的作用。溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易于得到。為了避免劇梯度來進行，一般組織從30％乙醇開始，經(jīng)過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對于一些柔軟的組織應(yīng)從15％開始。脫水時間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到如果中間須停頓，應(yīng)使材料停留在70％乙醇中，因為低濃度乙醇易導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。力和收縮力都比乙醇強。甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。二氧六環(huán)為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良后果，但其蒸氣有毒，使用時須小心?？棄K的收縮與變脆。使用。配制時應(yīng)以95%酒精作為基液加水稀釋,不要用無水酒精去配制,因無水酒精的價格較高,極不經(jīng)濟。配制方法如下：1．先將高濃度酒精注入量杯，其量同將要稀釋酒精濃度數(shù)字相等。2．加入蒸餾水，致總量達到原酒精濃度的數(shù)字量。例如：(一)用95%酒精配制成70%酒精時：(1)取95%酒精70毫升；(2)加蒸餾水使達到95毫升；稀釋后的酒精既為70%的酒精。(二)用80%酒精配制成60%酒精時：(1)取80%酒精60毫升；(2)加蒸餾水使達到80毫升；稀釋后的酒精既為濃度為60%的酒精.其余類推,其他的試劑的稀釋也均可以參照此方法進行配制。4．透明劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用較快，透明力強，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時若脫水不凈，就會引起不良后果，在應(yīng)用時必須特純二甲苯，這樣可減少上述的缺點。透明時間應(yīng)由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經(jīng)過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說時，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。5．透蠟和包埋包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、點為58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。24h且清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。透蠟須在恒溫箱中進行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點3處理。純石蠟應(yīng)處理2～3次，透蠟的時間依材料性質(zhì)而定，一般每次需15～30min。法滲透，溫度過高使組織收縮發(fā)脆。紙盒（具體折法見圖1-3鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放固，30min后取出。融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產(chǎn)生結(jié)晶。以后切片時引起碎裂。6．切片（1）石蠟塊的固著與整修片前還須進行固著和整修。也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后迅速切出所需的片子。面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識別切片。（2）切片機和切片刀和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪，標(biāo)運動一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢后應(yīng)及時用二甲苯將石蠟油擦凈。（3）切片方法夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度，片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉(zhuǎn)動，厚薄不均勻，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動的方向，以防標(biāo)本臺后移而切不到片子。切片完畢，應(yīng)及時用氯仿將切片機的有關(guān)部分擦凈。（4）切片中存在的問題及補救方法一些缺點、可能的原因以及補救辦法列于表表1-3石蠟切片可能產(chǎn)生的問題和解決方法缺點：石蠟帶彎曲不直原因：1．石蠟塊上下兩邊不平行2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行3．刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異4．蠟塊的一邊較另一邊為軟，或兩邊的硬度不一致5．材料未居蠟塊正中央6．材料大而形不正補救辦法：1．取下臺木，將兩邊修干2．調(diào)節(jié)標(biāo)本臺，使兩者平行3．移動刀片，改用新的刀口4．待蠟塊冷卻后再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中6．在大的一邊切去少許石蠟缺點：切片分離、不能連成帶狀原因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．材料邊緣留蠟太少4．刀的角度不適合補救辦法：1．在切片機上方開一電燈或提高室溫2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟?zāi)Σ翂K面3．重新包埋4．矯正刀的角度缺點：切片卷起呈圓筒狀原因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．刀口太鈍4．刀的傾角太大補救辦法：1．提高室溫2．加軟蠟3用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3片即成帶4．減小傾角缺點：切片粘附于切片刀，皺摺在一起原因：1．室溫過高2．石蠟過軟3．刀口上留有一層石蠟4．刀口鈍補救辦法：1．降低室溫2．將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加3．切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟4．磨刀或移動刀口缺點：切片縱裂原因：1．刀有缺口2．石蠟塊中含有顆粒、雜質(zhì)3．刀口留有碎屑或細絲4．組織太硬補救辦法：1．可移動刀口2．將顆粒拽去3．清潔刀口4．讓包埋塊在水中浸泡缺點：切片有橫紋原因：1．刀和臺木的固定螺絲太松2．刀口傾斜度太大3．刀口有石蠟屑補救辦法：1．旋緊螺旋2．可放平1—2。后再切3．用氯仿拭去缺點：切片厚薄不勻原因：1．切片機有毛病2．夾刀不當(dāng)3，未旋緊標(biāo)本臺螺旋4。石蠟塊過硬補救辦法：1．矯正切片機裝置2．對癥治療3．旋緊螺旋4．將石蠟塊在水中浸泡缺點：每張切片厚薄不勻原因：1．刀口震動，是由于材料過硬2．刀的傾角太大補救辦法：1。在蠟塊表面涂一層火棉膠2．減小傾角缺點：材料發(fā)生裂隙破碎或脫落原因：1．脫水不干凈2．有透明劑殘留3．石蠟透入時，溫度過高或時間過長4．由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發(fā)脆5．材料太硬或太粗補救辦法：1．無法彌補2．增加浸蠟時間，重新包埋3．無法補救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等進行脫水和透明5．在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液缺點：切片時發(fā)生沙沙聲原因：1．組織塊過硬2．包埋溫度過高3，材料內(nèi)留有結(jié)晶體補救辦法：1．浸泡水中軟化2．無法補救3．無法補救缺點：石蠟塊將蠟帶抬起原因：1．由于摩擦而產(chǎn)生靜電荷所致2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑3．刀口上附有石蠟碎屑補救辦法：1．提高室溫2．用刀片將碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除7．貼片有細小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法比較簡單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，5％明膠水溶液的載玻片傾斜著置一晝夜后使其徹底干燥。貼上去，再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最后將載玻片再度放燙板上晾干。不能有油污（檢驗法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，若8．染色構(gòu)。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經(jīng)過脫處理的時間大大減少，一般每級停留約2～5min。方法，例如顯示DNA的Feulgen反應(yīng)，顯示RNA的Brachet反應(yīng)，顯示多糖的PAS反應(yīng)，顯示蛋白質(zhì)的Millon反應(yīng)和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據(jù)不同的要求來選用。9．透明染色后的切片須再次經(jīng)過脫水、透明。標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。10．封藏劑互溶，對染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質(zhì)，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。免產(chǎn)生氣泡，也不得拖動蓋玻片，以免將標(biāo)本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。貼上標(biāo)簽，注明材料、染色法，待封藏劑凝固后便成為一張成功的石蠟切片。石蠟切片基本步驟之一器材和試劑一、準(zhǔn)備工作（一）用洗衣粉將玻璃器皿表里擦洗干凈反復(fù)洗刷將器皿在自來水下沖洗干凈將器皿倒扣在鋪有吸水紙或紗布的桌子上控干1~3次即可烘干備用，如果做特殊染色還需浸泡在酸性清潔液內(nèi)12~24底沖洗，再用蒸餾水過洗1~3次烘干備用。（二）配制：硫酸洗液的配制（三）載玻片與蓋玻片的處理1.將所需載玻片與蓋玻片清洗后，放入硫酸重鉻酸鉀溶液中浸泡24小時2.流水沖洗，再用蒸餾水沖洗3遍3.95%~100%酒精浸泡24小時，用綢布擦干備用注：在將載玻片與蓋玻片放入清潔液中時，要一片片地投入，使其不致重疊。二、準(zhǔn)備工作（二）常用液體的配制（一）緩沖溶液：1．磷酸鹽緩沖液A液：0.1mol/L磷酸二氫鈉B液：0.1mol/L磷酸氫二鈉A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸緩沖溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸鈉A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定劑：1．甲醛：10%甲醛福爾馬林100ml蒸餾水900ml注：實際甲醛含量只有3.6~4.0%但習(xí)慣上都將其視為2．10％中性福爾馬林鈣固定液甲醛液10ml蒸餾水90ml加碳酸鈣至過飽和(以容器底部碳酸鈣沉淀1~2cm厚為適度)充分振蕩混合后，放置24小時取上清液使用。3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸餾水100ml加溫至60℃左右，不時攪拌，成為乳白色溶液。滴加1NNaOH，并不停攪動至液體清明。1NNaOHlN等于1L溶液中某種物質(zhì)1mol除以該物質(zhì)的氫當(dāng)量價所得數(shù)值的量氧化鈉(NaOH)；分子量＝40．005，當(dāng)量價＝11NNa0H溶解于1L蒸餾水中4%多聚甲醛8%多聚甲醛50ml0.1M磷酸鹽緩沖液50mlPH7.2先取50ml8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氫鈉和0.1M磷酸氫二鈉將PH值調(diào)至7.24．Bouin液：苦味酸飽和水溶液75ml36％~40％福爾馬林液25ml冰醋酸5m15．改良Bouin氏固定液苦味酸飽和水溶液45ml95%酒精45ml36％~40％福爾馬林液5ml冰醋酸5m16．Carnoy液：冰醋酸10m1氯仿30m1無水乙醇60m1以上三者臨用前混合，預(yù)冷至4℃后使用。24小時后固定液失效。（三）染色液1．Harris蘇木精液A液：蘇木精1g無水酒精10mlB液：銨礬或鉀礬20g蒸餾水200ml氧化汞0.5ml冰醋酸8ml液）混入B1分鐘，染液變?yōu)樽仙?，將燒杯口用紗布蓋好，隔夜過濾，在過濾液內(nèi)