超氧化物歧化酶（SOD）的制備超氧化物歧化酶，簡稱SOD（SuperOxideDismutase）,是一種廣泛存在于動、植物及微生物中的金屬酶，至少可分為三種類型：第一種類型-Cu?Zn-SOD，呈藍(lán)綠色，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，分子量在32000左右，由兩個亞基組成，每個亞基含一個銅和一個鋅。第二種類型-Mn-SOD，呈粉紅色，其分子量隨來源不同而異。來自原核細(xì)胞的分子量約為4000,由兩個亞基組成，每個亞基各含一個錳；來自真核細(xì)胞線粒體的-Mn-SOD,由4個亞基組成，分子量約為80000。第三種類型-Fe-SOD，呈黃色，只存在于真核細(xì)胞中，分子量在38000左右，由兩個亞基組成，每個亞基各含一個鐵。此外，在牛肝中還存在一種-Co?Zn-SOD。自從1973年Weisiger等在雞肝中發(fā)現(xiàn)二種SOD以來，至今已采用了各種分離及分析方法，成功地從各種動物肝臟及血液中，分離純化了SOD。同時發(fā)現(xiàn)SOD的存在可能與機體衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病和輻射防護有關(guān)。目前臨床上主要用于延緩人體衰老，防止色素沉著，消除局部炎癥，特別是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及放射治療后的炎癥，無抗原性，毒副作用較小，是很有臨床價值的治療酶oSOD不僅在臨床上大顯身手，而且近年來又被廣泛的應(yīng)用于日用化工行業(yè)。含有SOD的化妝護膚品，對抗衰老及去除臉面雀斑等有顯著作用。添加SOD的化妝護膚品倍受女士的青睞，其產(chǎn)品具有很強的競爭力。如市場上銷售的奧琪、大寶、紫羅蘭、永芳等高級護膚化妝品，都因添加了SOD而成為搶手貨。隨著SOD被廣泛應(yīng)用于護膚霜、洗面奶、香皂等領(lǐng)域及活性氧、疾病診斷和抗輻射等方面的研究，SOD將成為廣大藥廠和日用化工廠的重要原料。目前我國大規(guī)模生產(chǎn)SOD廠家屈指可數(shù)，市場需求量大，在今后一段時間內(nèi)供應(yīng)將趨緊，因此充分利用動物廢棄物，生產(chǎn)SOD是大有發(fā)展前途的。（一）原料及試劑：1、 牛血或豬血：動物血液一定要保證新鮮，無污染。2、 氯化鈉：白色立方晶體或細(xì)小結(jié)晶粉末。相對密度2.165，熔點801°C。味咸，中性。有雜質(zhì)時易潮解。溶于水和甘油，難溶于乙醇。這里用于配制生理鹽水，選用一級工業(yè)品。3、 乙醇：又稱酒精，無色透明易揮發(fā)、易燃的液體。有酒味和刺激辛辣滋味。相對密度0.789。沸點78.4C。溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸濕性，能與水形成共沸混合物。其蒸汽與空氣形成爆炸性混合物。這里作溶劑用，選用工業(yè)乙醇。4、 丙酮：無色易揮發(fā)、易燃液體。有微香氣味。相對密度0.7893，沸點56.5C。于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶。能溶解油、脂肪、樹脂和橡膠。其蒸汽與空氣形成爆炸性混合物，化學(xué)性質(zhì)活潑。這里作溶劑用，選用工業(yè)丙酮。5、 氯仿：又稱三氯甲烷。無色透明易揮發(fā)的液體。稍有甜味。相對密度1.49，沸點61.2C。不易燃燒，微溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯、石油醚等。在光的作用下，能被空氣中的氧氧化成氯化氫和劇毒的光氣。這里用作溶劑，選用化學(xué)純試劑。6、 磷酸氫二鉀（^HPO/—磷酸二氫鉀（^PO4）緩沖液：配制方法如下：（1） 2.5微摩爾/升磷酸氫二鉀溶液的配制：一般市售的化學(xué)試劑其分子式為K2HPO4?3H2O,稱取0.569克溶解在1000克蒸餾水中，攪拌均勻。（2） 2.5微摩爾/升磷酸二氫鉀溶液的配制：如市售的化學(xué)試劑其分子式為KH,PO4,則在1000克蒸餾水中加入0.34克，攪拌均勻。如果分子式為KH2PO4?2H2O，則在1000克水中加入0.43克，攪拌均勻。（3）緩沖溶液的配制：按上述方法配好2.5微摩爾/升磷酸氫二鉀溶液和2.5微摩爾/升磷酸二氫鉀溶液后，將磷酸二氫鉀溶液緩緩地倒入磷酸氫二鉀溶液中，直至調(diào)整溶液的pH值至7.6為止。（4）50微摩爾/升磷酸氫二鉀—磷酸二氫鉀緩沖液的配制：完全照（一）.6之（1）~（3）項進行，只是分別將磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀的量加大20倍即可。7、 DEAE-SephadexA-50：它的全稱為二乙胺乙基葡聚糖凝膠離子交換劑，具有離子交換和分子篩的雙重作用。其結(jié)構(gòu)多孔、疏松，非特異性吸附很少，層析流速易控制，特別適用于蛋白質(zhì)、酶、激素、多核苷酸等的分離純化以及生化制劑的除熱原。DEAE-SephadexA-50是一種陰離子交換劑，各地生化試劑商店均有出售。用前應(yīng)預(yù)先處理，首先將它溶于水中（或5~10倍量洗脫劑中），最好將干膠往水里加，邊加邊攪拌，以防凝膠結(jié)塊。在室溫放置，完全水化后，再用水反復(fù)洗3~4次，同時瀝去水面上漂浮的細(xì)粉，用抽氣漏斗抽干。將抽干的膠浸泡于0.1摩爾/升的氯化氫溶液中20分鐘，濾去氯化氫溶液，用水洗至中性。再用0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液浸泡20分鐘，濾去氫氧化鈉溶液，用水洗至中性。最后再用0.1摩爾/升氯化納溶液浸泡20分鐘，濾去酸液，用水洗至中性，然后用磷酸緩沖液浸泡平衡即可使用。交換劑使用多次后吸附量降低，可按上述方法處理一遍，以保證交換劑的交換能力不降低。8、 檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7?2H2O）：又名枸櫞酸鈉。無色晶體或粒狀粉末。相對密3 6 5 7 2度1.875。150°C時失去結(jié)晶水，溫度再高則分解。溶于水，難溶于乙醇。這里作抗凝劑用，選用化學(xué)純試劑。（二）從牛血中提取SOD：1、加熱除雜蛋白工藝流程： 血漿（供制備凝血酶用）新鮮牛血（分離血球）—-血球一（提取 ”沉淀（棄去）?上清液（棄去）?上清液匕沉淀（沉淀）*上清液（回收丙酮）（沉淀） 雜質(zhì)（棄去）沉淀（溶于磷酸鉀緩沖液） 八、 上清液透析液（濃縮干燥）產(chǎn)品（DEAE-SephadexA-50透析液（濃縮干燥）產(chǎn)品2、操作步驟：（1） 分離血球：取新鮮牛血，按100千克牛血加3.8克檸檬酸三鈉投料，攪拌均勻，裝入離心管中，在離心機中以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，收集血球，血漿可用于制備凝血酶。（2） 提?。喊咽占难蛴?.9%氯化鈉溶液洗三遍（每次用血球2倍體積的氯化鈉溶液），然后加入蒸餾水（和牛血等量的水），在0?4°C條件下，攪拌溶血30分鐘，再緩慢加入溶血的血球0.25倍體積的95%乙醇和0.15倍體積（相當(dāng)于溶血的血球而言）的氯仿（乙醇和氯仿要事先冷卻至4C以下），攪拌均勻，靜置20分鐘，至離心機中離心30分鐘，收集上清液，棄去沉淀。（3） 沉淀：在上清液中加入2倍體積的冷丙酮，攪拌均勻，于冷處靜止20分鐘，離心收集沉淀。沉淀物用1—2倍體積的水溶解，在55C水浴中保溫15分鐘，離心收集上清液,再用2倍冷丙酮使上清液沉淀，靜置過夜。然后離心收集沉淀，上清液可回收丙酮。（4）DEAE-SephadexA-50分離純化：把以上沉淀溶于pH值為7.6、2.5微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，用離心法除去雜質(zhì)，收集上清液準(zhǔn)備上柱。先把DEAE-SephadexA-50裝入3X40厘米的柱中（即柱長40厘米，柱內(nèi)徑3厘米），用pH值為7.6、2.5微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液上柱，等流出液的pH值為7.6時，然后將樣品上柱，用pH值為7.6、2.5微摩爾/升~50微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液進行梯度洗脫（洗脫液濃度從2.5微摩爾/升開始逐漸加大至最終濃度達(dá)50微摩爾/升，這樣便形成一個洗脫梯度），收集具有SOD的活性峰，將洗脫液倒入透析袋中，在蒸餾水中進行活性透析（透析方法是利用小分子物質(zhì)在溶液中通過透析袋，而蛋白質(zhì)和粘多糖等大分子不能通過透析袋的性質(zhì)而達(dá)到不同大小分子分離的一種方法），然后將透析液經(jīng)超濾濃縮后，冷凍干燥即為SOD產(chǎn)品。3、磷酸氫二鉀法工藝流程：亠 一血漿（用于制備凝血酶）新鮮牛血（分離血球）―血球 （提取一*沉淀（棄去）一下層液（回收氯仿）■上清液 （萃?。蠈右? 上清液（回收丙酮）*雜質(zhì)（棄去）*雜質(zhì)（棄去）*清液 —沉淀（溶于磷酸鉀緩沖液）（DEAE-SephadexA-50分離純化）*洗脫液A-50分離純化）*洗脫液*透析液（超濾和凍干）產(chǎn)品4、操作步驟：（1）分離血球：取新鮮牛血，加入3.8%檸檬酸三鈉溶液（按100千克牛血加3.8克檸檬酸三鈉），攪拌均勻，裝入離心管中，以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，收集血球。血漿可用于制備凝血酶。（2）提?。菏紫扔?.9%氯化鈉溶液洗血球三遍，每次用血球2倍體積的氯化鈉溶液，然后加入等體積蒸餾水?dāng)嚢枞芙?0分鐘（0?4°C）。再緩慢加入溶血的血球0.25倍體積95%冷乙醇和0.15倍體積的冷氯仿（4C以下），攪拌15分鐘，靜置20分鐘，用離心法收集上層清液。（3） 萃取：在離心的上清液中，加入上清液40%重的K2HPO4,攪拌使K2HPO4充分混勻，然后倒入分液漏斗中分層，收集上層溶液。（4） 沉淀：將萃取分出的上層溶液倒入塑料桶中，加入2倍冷丙酮，攪拌均勻，靜置20分鐘，離心收集沉淀。（5）DEAE-SephadexA-50分離純化：把沉淀溶于pH值為7.6、2.5微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，然后離心分離出上清液。將上清液上DEAE-SephadexA-50柱（3X40厘米），用pH值為7.6、2.5微摩爾/升?50微摩爾/升的K,HPO4-KH2PO4緩沖液進行梯度洗脫，收集具有SOD的活性蛋白峰。然后將洗脫液裝入透析袋中在水中透析，最后將透析液超濾濃縮、凍干即得微帶藍(lán)綠色產(chǎn)品。三）從豬血中提取SOD1、工藝流程：”黃色血漿（用于制備凝血酶）新鮮豬血新鮮豬血（分離血球）（除血紅蛋白）*血紅蛋白（棄去）4清液（棄去）?離心液（沉淀）?沉淀（棄去）冷丙酮（除血紅蛋白）*血紅蛋白（棄去）4清液（棄去）?離心液（沉淀）?沉淀（棄去）冷丙酮、、、（執(zhí)變）-沉淀（執(zhí)變丿"上清液（回收丙酮） 上清液-*雜質(zhì)（棄去）*沉淀（溶于磷酸鉀緩沖液）（磷酸柱緩離液洗脫）洗脫液（磷酸柱緩離液洗脫）洗脫液 清液 *透析液（濃縮’干燥）》產(chǎn)品2、操作步驟：（1） 分離血球：取新鮮豬血，事先加入豬血體積1/7的3.8%檸檬酸三鈉溶液，攪拌均勻，以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，除去黃色血漿，收集紅血球。（2） 除血紅蛋白：紅血球用兩倍0.9%氯化鈉溶液離心洗滌三遍，然后向洗凈的紅血球加入等體積去離子水，劇烈攪拌30分鐘，于0?4°C靜置過夜。再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，攪拌15分鐘左右，靜置30分鐘，然后用離心法除去沉淀，收集微帶藍(lán)色的清澈透明粗酶液體。（3） 沉淀：向上述粗酶液中加入等量冷丙酮，攪拌均勻，即有大量白色沉淀產(chǎn)生，靜置30分鐘，用離心法收集沉淀物。（4） 熱變：把沉淀溶于pH值為7.6、2.5微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，加熱到55?65C，恒溫20分鐘，然后迅速冷卻到室溫，離心收集上清液，棄去沉淀物。在上清液中加入等體積的冷丙酮，靜置30分鐘，離心分出沉淀，脫水干燥即得粗品，可用于化妝品或食用SOD。（5） DEAE-SephadexA-50分離純化：把沉淀用pH值為7.6、2.5微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液溶解，用離心法除去雜質(zhì)，上清液上DEAE-SephadexA-50柱，用2.5微摩爾/升?50微摩爾/升K2HPO4-KH2PO4緩沖液進行梯度洗脫，收集具有SOD的活性峰。將洗脫液裝入透析袋中，在蒸餾水中透析，超濾濃縮透析液，然后冷凍干燥即得精品。（四）注意事項：（1） 牛血SOD對熱穩(wěn)定，豬血SOD對熱敏感。因此在分離過程中溫度應(yīng)控制在5C左右，最好在0C,時間不要超過4天。（2） 分理出的紅血球經(jīng)生理鹽水洗滌后，如暫不用，可冷凍保存，不影響其酶活力。（3） 上柱分離純化要注意pH值和鹽濃度，pH值控制酶分子的帶電狀態(tài)，鹽濃度控制結(jié)合鍵的強弱。為了得到高純度的SOD，常采用梯度洗脫（詳見附錄），也可以用DE-32、CM-32等作為交換劑。（4） 有機溶劑用量應(yīng)掌握適當(dāng)比例，在有機溶劑存在下，可有效的沉淀蛋白質(zhì)，但應(yīng)當(dāng)控制適當(dāng)溫度，方得到最佳分離效果。（5） 牛血SOD在pH值為5.3?9.5范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，豬血SOD在pH值為7.6?9范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，因此在提取過程中應(yīng)注意掌握SOD酶的最合適的pH值。（五）SOD活性及純度檢驗:1、 SOD活性檢驗：SOD活性檢驗比較經(jīng)典的方法是黃嘌吟氧化酶一細(xì)胞色素C法，簡稱CytC法：本法主要是有氧條件下，黃嘌吟氧化酶催化黃嘌吟或次黃嘌吟發(fā)生氧化反應(yīng)生成尿酸，同時產(chǎn)生超氧陰離子，氧化型高鐵CytC被超氧陰離子還原成亞鐵CytC。后者在550納米波長處有最大吸收。SOD抑制超氧陰離子對高鐵CytC的還原，因而測定高鐵CytC在加入SOD前后速度變化，可計算SOD的活力。在特定條件下引起高鐵CytC還原速度50%的抑制所需SOD的量定為1個活力單位。實驗的條件為：高鐵CytClO微摩爾/升，黃嘌吟50微摩爾/升，EDTA100微摩爾/升，磷酸鉀緩沖液50微摩爾/升，pH值為7.8，反應(yīng)溫度25°C，黃嘌吟氧化酶必須過量（5微摩爾/升）使CytC的吸收度變化為0.025/分。本測定法是最早建立的一種SOD分析方法，至今仍被認(rèn)為是一種可靠方法，不要求特殊儀器。2、 SOD純度檢驗：SOD純度可用聚丙烯酰胺凝膠電冰來測定其純度，看其在分子量32000左右的一條帶是否同標(biāo)準(zhǔn)品相同。六）生產(chǎn)設(shè)備:離心機1