碳鏈長度對雙鏈季銨鹽抑菌作用的影響

大自然的有害細(xì)菌、真菌和病毒是感染和預(yù)防人類疾病的主要原因。1915年，jykobs首次合成了季銨鹽酸鹽，指出這種化合物具有一定的殺菌效果。目前季銨鹽廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、飼料工業(yè)、農(nóng)業(yè)、紡織、塑料、橡膠、造紙、水處理、油田開采、涂料、日常生活等多種領(lǐng)域。已知雙鏈季銨鹽能殺滅病毒、細(xì)菌、霉菌、真菌等各類微生物,其消毒力不受有機物污染影響,也不受光、熱、硬水、酸堿度、溫度、濕度等的影響,藥效持續(xù)時間長;另外雙鏈季銨鹽也具有低毒、低腐蝕性和低刺激性的特點,且其殺菌效果與含氯消毒劑比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,是公認(rèn)的飲水消毒、水質(zhì)改良及控制禽畜疾病的良好消毒劑。雙鏈季銨鹽也可以和其它種類的表面活性劑進行復(fù)配,在消毒的同時還可以清潔物體的表面。近年來季銨鹽類消毒劑有不少新的進展,主要表現(xiàn)在新型季銨鹽的合成及殺菌性能的研究上,如經(jīng)兩步法合成了新型含酯基結(jié)構(gòu)季銨鹽殺菌劑HFAC,將其應(yīng)用與造紙污水上,當(dāng)用量0.01%、殺菌時間18h時,就能達到很好的殺菌效果;溴化芐基取代吡啶類季銨鹽具有較強的抗菌性能,且具有良好的物理性質(zhì),是一種新型的抗菌劑。但對同一系列雙鏈季銨鹽中碳鏈長度對該類消毒劑消毒能力的影響和殺菌機理的探索研究較少,以雙八烷基二甲基氯化銨、雙十烷基二甲基氯化銨、雙十二烷基二甲基氯化銨、雙十烷基二甲基溴化銨、雙十二烷基二甲基溴化銨和雙十八烷基二甲基溴化銨為研究對象,以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為受試菌,觀察不同碳鏈長度季銨鹽的殺菌效果。另外還對雙鏈季銨鹽的殺菌機理進行了驗證。1材料和方法1.1材料和機器1.2方法1.2.1脂斜面培養(yǎng)物的制備取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,用0.85%的氯化鈉溶液洗下菌體并混勻。用可見光分光光度計測量3種細(xì)菌OD600的值,然后用0.85%的氯化鈉溶液稀釋至其吸光值為0.065時備用。1.2.2中和劑抑菌試驗抑菌圈試驗。將100μL吸光值為0.065的菌懸液均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板表面,抑菌片為直徑5mm濾紙片,每個抑菌片含3層濾紙,經(jīng)壓力蒸汽滅菌后干燥備用。在抑菌片上滴加10μL樣品,陰性對照用氯化鈉溶液代替樣品。每個平板貼放3個抑菌片,其一作空白對照,一種藥物做2種濃度。貼放后用無菌鑷子輕壓樣片,使其緊貼于平板表面,37℃培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。準(zhǔn)確測量抑菌圈直徑,根據(jù)抑菌圈直徑大小比較各消毒劑抑菌效果。試驗藥品取兩種濃度(1g·L-1和5g·L-1),比較這些藥品的抑菌作用強弱。中和劑鑒定試驗。受試菌為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌,設(shè)計6組試驗,按懸液定量殺菌試驗程序進行。(1)消毒劑+菌懸液→培養(yǎng);(2)(消毒劑+菌懸液)+中和劑→培養(yǎng);(3)中和劑+菌懸液→培養(yǎng);(4)(消毒劑+中和劑)+菌懸液→培養(yǎng);(5)稀釋液TPS+菌懸液→培養(yǎng);(6)稀釋液TPS+中和劑→培養(yǎng)。結(jié)果以(1)組無菌生長,(2)組有細(xì)菌生長但菌落數(shù)遠(yuǎn)少于(3)(4)(5)組,(3)(4)(5)組的菌落數(shù)近似相等組間誤差率不超過15%,而(6)組無菌生長,則表明所選中和劑合格。懸液定量殺菌試驗。試驗依據(jù)為衛(wèi)生部《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版),實驗消毒液為無菌硬水配制的原濃度樣品,在無菌試管內(nèi)加入試驗菌懸液1.0mL。置20℃水浴恒溫后,加入4.0mL樣液混勻,作用至預(yù)定時間。取0.5mL混合液加入到裝有4.5mL中和劑的試管中,混勻。中和作用10min充分混勻取樣液。37℃恒溫培養(yǎng)24h,進行菌落計數(shù),計算殺菌率。以稀釋液代替復(fù)配消毒液樣品液接種,作為陽性對照組。1.2.3中和劑用量的制備將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~14h,轉(zhuǎn)速180r·min-1;取濃度為5g·L-1DDAC8的水溶液5mL(對照組為蒸餾水),加菌液5mL,混勻。于室溫中作用至預(yù)定時間,以4000r·min-1離心10min,棄去上清液,加中和劑(含有1%卵磷脂和1%吐溫80的溶液),再離心棄去上清液。按透射電鏡生物樣本制備步驟進行樣品制備。1.2.4脂質(zhì)體混懸液的制備將卵磷脂和膽固醇以質(zhì)量比為4:1混合,溶于適量氯仿中,然后將該氯仿溶液在茄形瓶中旋轉(zhuǎn)震蕩,直至形成均勻的懸濁液,再在一定溫度的水浴中攪拌數(shù)小時即得到脂質(zhì)體混懸液,4℃保存待用。取適量脂質(zhì)體乳濁液于載玻片上,放在顯微鏡下觀察。2對其他季銨鹽的抑制殺菌能力測定抑菌圈直徑法是經(jīng)常被用來檢測抗菌劑抗菌活性的方法之一,試驗通過該方法分別測定了上述6種季銨鹽單品和一種復(fù)合消毒劑對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制殺滅能力。消毒劑的抑菌圈直徑越大,表明抗菌能力越強。2.1雙鏈季銨鹽的殺菌機理試驗結(jié)果清楚地表明,在1g·L-1和5g·L-1兩種濃度下,3種雙鏈季銨鹽氯化物的抑菌圈直徑都比較大,尤其是對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌,顯示出它們具備良好的殺菌能力,其抑菌圈直徑大小順序為DDAC8>DDAC10>DDAC12(結(jié)果參見表1)。其原因可能是:有關(guān)雙鏈季銨鹽的殺菌機理,大量實驗研究表明其作用位點是細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜,對于小分子季銨鹽與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上磷脂雙分子層相互作用的原理,也進行了大量研究工作。雙鏈季銨鹽離子具有[(CH3)2,NR2]+,其結(jié)構(gòu)為直鏈型,這類有機陽離子具有不隨pH值變化的永久正電荷。當(dāng)季銨鹽離子被吸附到細(xì)菌體表面時,這些正電荷可以和其質(zhì)膜上的負(fù)電荷相互作用,改變細(xì)菌胞漿膜通透性,使菌體內(nèi)重要的酶和營養(yǎng)物質(zhì)外滲,使病原微生物的呼吸及糖酵解過程受阻,菌體蛋白變性,水向菌體內(nèi)滲入使病原體破解或者融裂而死亡,從而呈現(xiàn)殺菌作用。當(dāng)雙鏈季銨鹽碳鏈長度增加時,其吸附力會隨之下降,這就直接影響了消毒劑與菌體接觸這一決定性的條件,從而影響其殺菌效果。2.2雙鏈銨鹽溴化物系列的抗菌效果2.3l-1質(zhì)量濃度復(fù)合消毒液的抑菌效果同樣條件下進行抑菌圈試驗,結(jié)果表明1g·L-1和5g·L-1兩個濃度含DDAC8的復(fù)合型季銨鹽消毒液抑菌效果良好(表3)。在1g·L-1濃度下,復(fù)合消毒液的抑菌圈直徑要比上述6種單品中對大腸桿菌抑制效果最好的DDAC8大0.24cm。這也表明不同的季銨鹽之間進行恰當(dāng)?shù)膹?fù)配后會使殺菌效果增強,其原因可能是不同季銨鹽分子的相互協(xié)同作用,增強了對菌體吸附,進而加快了菌體的裂解速度。2.4中和劑評價試驗結(jié)果2.5ddac8作用前后菌體形態(tài)變化正常大腸桿菌在透射電鏡下觀察,呈兩端鈍圓的桿狀,表面光滑,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整,細(xì)胞壁緊貼細(xì)胞膜(圖1A)。經(jīng)DDAC8作用10min后,發(fā)現(xiàn)菌體變形(圖1B,C),胞壁胞膜間空隙增寬,細(xì)胞壁表面出現(xiàn)部分模糊不清,且有明顯斷裂處。透射電鏡所見正常金黃色葡萄球菌呈規(guī)則的橢圓形,表面光滑完整(圖2-A)。經(jīng)DDAC8作用10min后,菌體部分變形,變化比大腸桿菌小,表面粗糙,凹凸不平,局部細(xì)胞壁缺損,細(xì)胞外膜顯得不規(guī)則(圖2-B)。以上透射電鏡的觀察結(jié)果表明,雙鏈季銨鹽與菌體接觸后通過破壞其細(xì)胞膜,致使細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外的表面張力改變,細(xì)胞膜的穩(wěn)定性受損,細(xì)胞內(nèi)容物漏出,最終導(dǎo)致菌體裂解死亡。脂質(zhì)體是由連續(xù)的雙層或多層復(fù)合脂質(zhì)組成的人工小球囊,可以作為生物膜的實驗?zāi)Ｐ汀傊苽浜玫闹|(zhì)體是在顯微鏡的觀察下呈現(xiàn)為規(guī)則的球形小體,大小不一,在溶液中密集排列(圖3-A);與蒸餾水混合后顯微鏡下的脂質(zhì)體數(shù)量有所減少,但是形態(tài)沒有變化(圖3-B);經(jīng)DDAC8作用后,脂質(zhì)體的數(shù)量明顯減少,且形狀變得不規(guī)則,有部分脂質(zhì)體聚合成片(圖3-C)。上述試驗結(jié)果說明雙鏈季銨鹽的確可以作用于生物膜,并通過改變膜的表面張力使其發(fā)生形變進而破裂或者聚合。3抑菌圈試驗檢測本試驗表明,雙鏈季銨鹽碳鏈長度對其殺菌活性有非常重要的影響,在C8-C18范圍內(nèi),隨著雙鏈季銨鹽碳鏈長度的增加,其殺菌活性逐漸減小。用抑菌圈試驗來判定雙鏈季銨鹽消毒劑的抑菌活性,其結(jié)果除了與消毒劑殺菌原理有關(guān),與其分子大小及在瓊脂上的擴散能力也有一定關(guān)系。6種雙鏈季銨鹽單品對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌比對大腸桿菌有更強的殺滅能力。將季銨鹽單品與其他成分進行適當(dāng)?shù)膹?fù)配后,能顯著的提高消毒劑的殺菌能力。雙鏈季銨鹽是通過改變細(xì)胞膜的表面張力而作用于細(xì)菌的,并經(jīng)過一系列的生化過程最終呈現(xiàn)殺菌效應(yīng)。雙八烷基二甲基氯化銨(DDAC8)、雙十烷基二甲基氯化銨(DDAC10)、雙十二烷基二甲基氯化銨(DDAC12)、雙十烷基二甲基溴化銨(DDAB10)、雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB12)、雙十八烷基二甲基溴化銨(DDAB18),6種藥品均是由廈門先瑞科技有限公司提供,JEM100C11透射電鏡(日本奧林巴斯),顯微鏡(萊卡DM4000B)。DDAB10、DDAB12、DDAB18對3種受試菌的抑菌圈直徑被總結(jié)在表2。結(jié)果表明,在1g·L-1和5g·L-1兩個試驗濃度下,對大腸桿菌的抑菌作用大小順序為DDAB10>DDAB12>DDAB18;對枯草芽孢桿菌亦是DDAB10抑菌效果最為明顯,其中在濃度為5g·L-1時抑菌圈直徑達到1.20cm,DDAB12與DDAB18未表現(xiàn)出抑制作用;然而對金黃色葡萄球菌DDAB10與DDAB12表現(xiàn)出了相同抑制作用,在1g·L-1時抑菌圈直徑均為0.93cm,且在濃度為5g·L-1時,DDAB12的抑菌圈直徑比效果DDAB10還要大0.25cm,DDAB18效果最差。通過該組試驗數(shù)據(jù),可以看出總體上DDAB10與DDAB12的殺菌效果接近,但與DDAB18差異很大。這說明用抑菌圈試驗來判定雙鏈季銨鹽消毒劑的抑菌活性,其結(jié)果除了與消毒劑殺菌原理有關(guān),與其在瓊脂上的擴散能力也有一定關(guān)系。碳鏈短的分子與碳鏈長的分子相比,其在瓊脂上的擴散能力也比較強,擴散速度大,結(jié)果在一定的時間內(nèi)就會出現(xiàn)較大的抑菌圈。DDAB10和DDAB12結(jié)構(gòu)大小相近,所以擴散能力也相近,故表現(xiàn)出相似的抑菌效果,DDAB18的分子最大,擴散能力相對較小,故會表現(xiàn)出較差的抑菌效果。結(jié)果表明,以0.5%組氨酸、1%吐溫-80、0.5%卵磷脂的溶液作為中和劑,可以有效中和5g·L-1含有DDAC8成分的復(fù)合消毒液的抑菌作用,中和劑或中和產(chǎn)物對受試菌生長及