干細胞培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)2023/10/7細胞培養(yǎng)：概念：在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體取出的細胞，并使之生存和生長的技術(shù)稱為細胞培養(yǎng)2023/7/28細胞培養(yǎng)：概念：在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，2023/10/7體外細胞培養(yǎng)的條件：體外細胞培養(yǎng)必須注意三個環(huán)節(jié)：營養(yǎng)、生存環(huán)境和廢物的排除。體外培養(yǎng)細胞所需的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基提供的。體外培養(yǎng)必須模擬體內(nèi)細胞生長的環(huán)境。環(huán)境因素主要是指無菌環(huán)境、合適的溫度、一定的滲透壓和氣體環(huán)境。2023/7/28體外細胞培養(yǎng)的條件：體外細胞培養(yǎng)必須注意三2023/10/7概述：干細胞是一種自我更新、高度增殖以及多種分化潛能的未分化細胞。各種功能細胞的生成及其調(diào)控依賴于各種微環(huán)境、細胞生長因子、基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)等多種因素的相互作用與平衡，并涉及有關(guān)細胞增殖、分化、遷移、定居、衰老、凋亡、癌變等許多生命科學(xué)中的基本機制。2023/7/28概述：干細胞是一種自我更新、高度增殖以及多2023/10/7來源：干細胞有多種來源，根據(jù)其來源的種屬可以分為人干細胞、小鼠干細胞、牛干細胞、豬干細胞、大鼠干細胞等；根據(jù)其來源的部位可以分為胚胎干細胞、造血干細胞、骨髓基質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、肝干細胞、生殖干細胞、胰腺干細胞等。2023/7/28來源：干細胞有多種來源，根據(jù)其來源的種屬可2023/10/7分類：干細胞有兩種分類：一是根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。第二種分類方法是根據(jù)干細胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。胚胎干細胞的發(fā)育等級較高，是全能干細胞，而成體干細胞的發(fā)育等級較低，是多能或單能干細胞。2023/7/28分類：干細胞有兩種分類：一是根據(jù)干細胞所處2023/10/7特點：①干細胞本身不是終末分化細胞（即干細胞不是處于分化途徑的終端）；②干細胞能無限增殖分裂；③干細胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；④干細胞分裂產(chǎn)生的子細胞只能在兩種途徑中選擇其一——或保持親代特征，仍作為干細胞，或不可逆的向終末分化。2023/7/28特點：①干細胞本身不是終末分化細胞（即干細2023/10/7胚胎干細胞：ES細胞胚胎干細胞是一種經(jīng)人工操作能夠發(fā)育成一個新個體的全能性二倍體細胞。它是從早期胚胎內(nèi)細胞團或原始胚胎生殖細胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分離克隆的，二者的形態(tài)、標(biāo)志、體內(nèi)分化潛能及種系傳遞功能都相似。2023/7/28胚胎干細胞：ES細胞胚胎干細胞是一種經(jīng)人工2023/10/7ES細胞主要特性：1、ES細胞在不同條件下具有不同的功能狀態(tài)，它是飼養(yǎng)層細胞以來的。在有抑制因子存在的條件培養(yǎng)基中，它呈未分化狀態(tài)生長；在無抑制因子存在的培養(yǎng)基中，分化成各種細胞；在懸浮培養(yǎng)時，可形成胚狀體。2、ES細胞具有分化成各種類型細胞的多潛能性，此種特性既可以在體內(nèi)發(fā)育，也可在體外誘導(dǎo)。2023/7/28ES細胞主要特性：1、ES細胞在不同條件下2023/10/7小鼠胚胎干細胞的體外培養(yǎng)：概述：小鼠胚胎生殖細胞是生殖嵴的原生殖細胞，被認為具有胚胎干細胞的自我更新能力和多能分化能力，因此可以被視為胚胎性干細胞。2023/7/28小鼠胚胎干細胞的體外培養(yǎng)：概述：小鼠胚胎生2023/10/7用品：⑴培養(yǎng)基試劑和用品：胎牛血清、新生牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、bFGF（促有絲分裂因子）、Percoll細胞分離液、絲裂霉素C、NBT/BCIP試劑盒、胰蛋白酶、細胞培養(yǎng)用品和設(shè)備、玻璃吸管，顯微外科手術(shù)器械、倒置顯微鏡、解剖顯微鏡、普通離心機等。⑵實驗動物：昆明小白鼠，8~10周齡，體重30~35g。2023/7/28用品：⑴培養(yǎng)基試劑和用品：胎牛血清、新生牛2023/10/7步驟：⑴獲取胎鼠成纖維細胞（MEFs）:將雌鼠與雄鼠合籠，次日見陰拴者記為0.5d，取10~14d的胎鼠，去除胎胚頭和內(nèi)臟，無菌PBS漂洗兩遍，用眼科剪充分剪碎，轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，加入20~30ml細胞消化液（PBS液，含0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA）37℃輕輕震蕩消化約30min，過200目細胞篩，PBS離心漂洗2次，重懸細胞并接種，按普通方法傳代，凍存，備用。換液時收集細胞上清液，4000r/min離心15min，過濾后使用。2023/7/28步驟：⑴獲取胎鼠成纖維細胞（MEFs）:將2023/10/7⑵MEF飼養(yǎng)層的制備：取80%融合的MEFs，加入10ug/ml絲裂霉素C，在CO2孵箱中孵育2H，加入細胞消化液，再用飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)液中和并吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度到4x10^5個/ml，在六孔板中每孔加入3ml，置CO2孵箱中待用。2023/7/28⑵MEF飼養(yǎng)層的制備：取80%融合的MEF2023/10/7⑶獲取胚胎生殖細胞：取10d的胎鼠，在解剖顯微鏡下借助顯微外科器械，于其腰骶部尋找并分離生殖嵴，再轉(zhuǎn)移到胰酶中，用細口徑吸管吹打，把生殖嵴消化成單細胞懸液，以0.5個胚胎/孔轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)層細胞上，加入胚胎干細胞培養(yǎng)液（a-MEM，10%胎牛血清，1mmol/L丙酮酸鈉，2mmol/L非必需氨基酸，2mmol/L左旋谷氨酰胺，100U/mL，bFGF）置于CO2孵箱中。2023/7/28⑶獲取胚胎生殖細胞：取10d的胎鼠，在解剖2023/10/7胚胎生殖細胞的常規(guī)培養(yǎng)：每日更換培養(yǎng)基，接種0d左右，選擇鳥巢狀并分化明顯的細胞集落，按照常規(guī)手工挑克隆的方法選擇并傳代，或者使用Percoll液配制成細胞分離液，常規(guī)消化后進行梯度離心，選擇含原生殖細胞最多的部分再進行分離，最后接種在新的飼養(yǎng)層細胞上。2023/7/28胚胎生殖細胞的常規(guī)培養(yǎng)：每日更換培養(yǎng)基，接2023/10/7ES細胞的分化抑制培養(yǎng)：

在ES細胞的培養(yǎng)過程中，一方面要給以足夠的營養(yǎng)物質(zhì)以滿足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基礎(chǔ)培養(yǎng)基來解決，后者則由分化抑制物來完成。2023/7/28ES細胞的分化抑制培養(yǎng)：在ES細胞的培2023/10/7分化抑制物的選擇：目前有三種分化抑制物比較常用：飼養(yǎng)層（feederlayer）條件培養(yǎng)基（conditionedmedium，CM）白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor,LIF）2023/7/28分化抑制物的選擇：目前有三種分化抑制物比較2023/10/7成體干細胞：成體干細胞包括：造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、肌干細胞、成骨干細胞、內(nèi)胚層干細胞和視網(wǎng)膜干細胞等。2023/7/28成體干細胞：成體干細胞包括：造血干細胞、骨2023/10/7神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)：用品：⑴條件培養(yǎng)基：DMEM/F12=1:1、20ng/mLbFGF（促有絲分裂因子）、100ug/mL胰島素。⑵0.25%胰蛋白酶。⑶D-Hanks液：NaCl8g、KCl0.4g、NaHPO4·H2O0.06g、KH2PO40.35g、酚磺酞0.02g，加水1000mL溶解，調(diào)PH值為7.2~7.4，高壓滅菌，4℃儲存。⑷手術(shù)刀、彎鉗、眼科剪、1mL注射器、手術(shù)彎盤、青霉素小瓶、細胞計數(shù)板。2023/7/28神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)：用品：2023/10/7步驟：⑴取2周齡Wistar孕鼠1只，處死，70%乙醇消毒5min，剪開腹部皮膚打開腹腔，切取子宮，轉(zhuǎn)入無菌90mm培養(yǎng)皿中。⑵眼科剪從子宮處取出胎鼠，D-Hanks液沖洗，置冰臺上，用眼科剪剪開頭骨，小心將腦組織移入另一無菌90mm培養(yǎng)皿中，D-Hanks液沖洗。2023/7/28步驟：⑴取2周齡Wistar孕鼠1只，處死2023/10/7⑶去除腦膜及血管，用手術(shù)刀反復(fù)切割腦組織，過200目篩，制成單細胞懸液。⑷細胞計數(shù)，以10^6個/mL細胞密度接種于塑料培養(yǎng)瓶中，加入條件培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度恒溫箱中培