第五章聚合酶鏈式反應（PCR）基因擴增（geneamplification)1.環(huán)境誘發(fā)擴增在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產生明顯的擴增。如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴增。2.基因的程序性擴增在發(fā)育的某個階段，某些基因的大量擴增。如非洲爪蟾卵子形成過程中rRNA基因的擴增。3.基因組進化擴增生物進化過程中基因組中某些基因的拷貝數增加，結果相關的基因聚集成簇。4.基因工程擴增載體攜帶目的基因在寄主細胞中大量復制。5.PCR擴增應用聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）技術，在體外特異性地擴增某個基因。第五章聚合酶鏈式反應（PCR）基因擴增（geneamp5.1（1）1971年Khorana提出體外人工復制DNA的設想。由于引物和DNA聚合酶及DNA測序技術都沒有解決，設想未能實現。（2）1985年Cetus公司的科學家K.B.Mullis發(fā)明了PCR，使這一設想變成現實PCR的發(fā)明Mullis由此獲得1993年諾貝爾化學獎。5.1（1）1971年Khorana提出體外人工復制DNA的（3）TaqDNA聚合酶1986年H.A.Erilish從嗜熱水生菌分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替Klenow片段，PCR技術才進入實用階段。1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反應中，使PCR自動循環(huán)儀成為可能。（4）PCR儀1988年Cetus公司發(fā)明自動熱循環(huán)儀。（3）TaqDNA聚合酶5.2PCR擴增原理

PCR?

是在模板DNA、引物和dNTPS存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。其擴增原理是以半保留復制的形式進行，在體外進行DNA的變性、退火和引物延伸三個階段的循環(huán)反應。5.2PCR擴增原理基因工程PCR課件PolymeraseChainReaction(PCR)

根據已知的DNA核苷酸序列從兩個5’-端合成兩條16~24bp的引物PolymeraseChainReaction(PCR基因工程PCR課件

要進行PCR反應，必須對目的基因片段兩側的序列了解清楚，至少要預先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。就可通過PCR反應，直接從染色體DNA或cDNA上高效快速地擴增出目的基因片段。要進行PCR反應，必須對目的基因片段兩側的序5.3PCR技術特點pg、ng的DNA模板分子即可。（1）特異性強錯配率約萬分之一（2×104）。擴增產物的特異性取決于引物和模板DNA結合的特異性。（2）敏感性高5.3PCR技術特點pg、ng的DNA模板分子即可。（（4）簡便擴增產物直接作序列分析和分子克隆，不必按常規(guī)方法先克隆再做序列分析。（3）快速整個PCR過程約4hr完成。樣品處理約1hr

，PCR2hr，產物凝膠電泳分析約1hr。（4）簡便擴增產物直接作序列分析和分子克隆，不必按常規(guī)方法先Clark發(fā)現用TaqDNA聚合酶得到的PCR反應產物不是平末端，而是有一個突出A堿基末端的雙鏈DNA分子，根據這一發(fā)現設計了克隆PCR產物的T-載體。利用Taqpolymerase的特性Clark發(fā)現用TaqDNA聚合酶得到的PCR反應產利用restrictionenzyme利用restrictionenzyme（5）可擴增RNAorcDNA有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難于將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作為模板，可將外顯子集中，用PCR一次完成對某些外顯子的擴增并進行序列分析。RT-PCR：先用逆轉錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進行擴增。（5）可擴增RNAorcDNA有些外顯子分散在一段很長的

模板可以是cDNA的第一條鏈，也可以是總DNA。模板可以是cDNA的第一條鏈，也可以是總DNA。對大批量PCR產物分析不影響，但用于克隆的DNA，必須檢測克隆產物的DNA序列。（6）對材料（模板）質量要求低微量、粗制及部分降解的DNA材料都可作為起始材料。（7）有一定程度單核苷酸錯誤摻入對大批量PCR產物分析不影響，但用于克隆的DNA，必須檢測克

5.4

PCR反應體系1.TaqDNA聚合酶①熱穩(wěn)定性TaqDNA聚合酶的最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復高溫變性要求。②最適溫度高最適溫度：75~80℃

延伸速度：35~150nt/(s·酶分子)最長延伸長度：6.7kb③Taq酶的缺點具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，但沒有3’-5’外切酶活性，因此不能修正錯誤的堿基配對！合成超過600bp長度的DNA就有可能出現錯配，用于克隆基因時必須測序。5.4PCR反應體系①熱穩(wěn)定性TaqDNA聚合其它耐熱的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶無3’

→5’DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉錄cDNA，又能擴增DNA。②VENTDNA聚合酶有3’→5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯配。能耐受100℃高溫。③PfuDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。是目前已發(fā)現的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯率最低的。但PCR產物為平端?、躎aqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR產物3’端往往帶有一個A。其它耐熱的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶無3’→5①純度PCR對模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA等試劑。②用量一般50μl反應體系中50ng即可，模板太多，會令擴增失敗。2.模板(template)①純度PCR對模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、3.引物（primer）終濃度0.5μmol/L4.dNTPs濃度一般反應體系中dNTP混合濃度為200μmol/L，濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯配率。3.引物（primer）終濃度0.5μmol/L4.dNTP5.Mg2+濃度

~2.0mmol/LTaqDNA聚合酶對金屬離子的性質和濃度較敏感，特別是Mg2+

。在4種脫氧核苷酸dNTP的總濃度~0.2mmol/L時，濃度為2.0mmol/L的MgCl2能最大程度地激活TaqDNA聚合酶的活性，過高則對酶活性表現出一定的抑制作用。5.Mg2+濃度~2.0mmol/L

5.5PCR反應條件

1.變性：94℃~95℃，1min，預變性5~10min。

2.引物的退火：

Tm=（G+C）×4+（A+T）×2。實際復性溫度低于Tm值5℃，當引物中（G+C)含量低于50%時，復性溫度低于55℃。提高退火溫度，可提高引物與模板結合的特異性。時間30~60s。5.5PCR反應條件3.延伸溫度和時間：一般72℃，1min。延伸時間過長，非特異擴增帶出現，但最后一步可延長4~10min，使反應完全，產量高。4.循環(huán)數：25~40周期，次數少，產量不夠；次數過多，反應停止，呈平臺效應。3.延伸溫度和時間：一般72℃，1min。延伸時間過長，非

5.6PCR引物設計原則a.長度15

~30bp，Tm55℃～75℃

。b.G+C占50%

~60%，避免單一堿基的連續(xù)排列，一般兩端G+C含量近似。c.引物3’端必須與模板DNA互補。d.一對引物間連續(xù)互補堿基小于4個。e.引物本身應避免有回文序列。5.6PCR引物設計原則410=1.05×106(百萬),420=1.1×1012(萬億)引物的長度一般引物設計為長15-30bp。即1.1×1012bp的基因組中有一次完全與20個核苷酸的序列相同的機會6~12bp為隨機引物，在基因組中與隨機引物完全相同的序列可能有多個，因而擴增時可以產生多個片段，因此多用于生物的分類學研究。410=1.05×106(百萬),420=1.1×101引物的堿基序列3’端必須與模板正確配對，5’端可以不配對。5’端根據需要可設計成某個內切酶的切點順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點或生物素標記等，方便與以后操作。引物的堿基序列3’端必須與模板正確配對，5’端可以不配對。5引物的堿基組成

①

提高G+C含量，以提高引物與模板的結合力。②避免連續(xù)相同堿基排列或內部回文序列。引物的堿基組成①提高G+C含量，以提高引物與模板的結合力③避免形成引物二聚體（dimer）兩個引物之間不能有兩個以上的連續(xù)堿基序列互補。③避免形成引物二聚體（dimer）

簡并引物：根據蛋白質的氨基酸序列設計一組混合引物來合成相應的基因。例如：HisPheProPheMetLys5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’

其中：Y=嘧啶(UC)，R=嘌呤(AG)，N=任意堿基該序列具有2×2×4×2×2=64倍簡并性，其中之一必是正確的。組苯丙脯甲硫賴簡并引物：根據蛋白質的氨基酸序列設計一組混合引物來合成相

嵌套引物（nestedprimers)：設計多組引物，結合位點依次位于前一組引物之間。利用第一輪PCR擴增產物作為第二輪PCR擴增的起始材料，進行二次PCR擴增。這樣能夠使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增，增加擴增產物的特異性。引物設計現在多用專業(yè)軟件如Primer5.0等嵌套引物（nestedprimers)：引物設計現在多5.7PCR技術的擴展技術關鍵：把線性DNA模板轉變成環(huán)形分子，使引物的外側序列“轉變”

成內側序列。（1）反向PCR

擴增兩個引物外側的未知序列（傳統PCR只擴增兩個引物之間的已知序列）。5.7PCR技術的擴展技術關鍵：（1）反向PCR基因工程PCR課件技術關鍵：兩個引物的濃度相差100倍。低濃度的引物（限制引物）首先耗盡，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈DNA，最后產物中99%是單鏈DNA?？捎糜赟anger法測序。

（2）不對稱PCR用于擴增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測序。技術關鍵：兩個引物的濃度相差100倍。（2）不對稱PCR用技術關鍵：利用反轉錄酶，把RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。（3）反轉錄PCR（RT-PCR)擴增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。Temin,H.發(fā)現反轉錄酶，1975諾貝爾獎技術關鍵：（3）反轉錄PCR（RT-PCR)擴增RNA模板?；蚬こ蘌CR課件5.8PCR技術的應用（1）擴增某一段DNA基因組克?。和蛔兓蛲吧突虻谋容^。通常先構建突變體的基因文庫，再應用雜交篩選等一系列煩瑣的步驟，分離到所需的克隆。然后對突變基因測序并同野生型進行分析比較。利用PCR則可根據野生型基因的序列，設計一對合適的引物，從基因組(突變體)中直接擴增突變基因DNA產物，供測序使用。5.8PCR技術的應用（1）擴增某一段DNA基因組克?。杭夹g關鍵：利用引物的5’端序列不要求與模板嚴格配對，設計引物時引入突變序列。（2）基因的體外誘變

在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復、插入、替換等）。技術關鍵：（2）基因的體外誘變用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作為引物，啟動單鏈DNA分子進行復制，隨后這條引物便成為新合成DNA子鏈的一個組成部分纈蘇用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作為引物，啟動單鏈DN基因工程PCR課件克服單鏈引物法只能誘變5’的局限性

克服單鏈引物法只能誘變5’的局限性（3）基因組的比較研究比較不同物種之間的基因組特征和相似性。利用6bp長度的隨機序列引物擴增細胞中的總DNA，將會得到許多非特異性產物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。類似于限制性內切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）分析，因而也稱為隨機擴增多態(tài)性DNA（RandomamplifiedpolymorphismDNA,RAPD）分析。（3）基因組的比較研究?

隨機引物非定點地擴增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴增片段。?

基因組DNA如果在特定引物結合區(qū)域發(fā)生

DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導致引物結合位點的分布發(fā)生相應的變化，導致PCR產物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。?PCR可以比較兩種不同生物的基因組的差異。親緣關系較近的兩種生物比較遠的生物產生更多的相同的條帶。?隨機引物非定點地擴增基因組DNA，然后用基因工程PCR課件基因工程PCR課件（4）DNAshufflingworks

Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randoman