資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)或者侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系改正或者刪除。(此文檔為word格式,下載后您可任意編輯修改!)基于順鉑抗癌藥物的合成及DNA鍵合性質(zhì)的研究【摘要】癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見病和多發(fā)病,已經(jīng)成為人類死亡的第二大病因。自1967年發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗癌活性以來,經(jīng)過30多年的發(fā)展,鉑類金屬抗癌藥物的合成應(yīng)用和研究得到了迅速的發(fā)展。與此同時(shí),研究藥物和DNA的相互作用是藥物發(fā)現(xiàn)和藥品研發(fā)過程中最重要的課題之一。G-四鏈體是富含鳥嘌呤堿基的DNA經(jīng)過氫鍵相互作用形成的四鏈螺旋結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)能夠有效的抑制端粒酶的活性,它能夠阻礙端粒酶對(duì)端粒DNA引物的識(shí)別,使細(xì)胞正常凋亡,從而達(dá)到抗腫瘤的效果,近年來,以G-四鏈體為靶點(diǎn)的抗癌藥物研究引起了人們的廣泛注意。本文的工作重點(diǎn)是合成配合物,經(jīng)過紫外滴定和熒光滴定手段研究已有釕配合物對(duì)G-四鏈體穩(wěn)定性、DNA對(duì)金屬離子的特異性識(shí)別?！娟P(guān)鍵詞】鉑(II)配合物,G-四鏈體,DNA,釕(II)配合物。ApplicationofBjerrumFunctioninDeterminationofStabilityConstants【Abstract】Cancerisacommonandfrequently-occurringdiseasesseriouslythreateningdeathcause.Sincecisplatinwasfound1967,after30yearsofdevelopment,thesyntheticapplicationsandresearchofmetalanti-cancerdrugsofplatinumobtainedarapiddevelopment.Atthesametime,theresearchofthereactionbetwwendrugsandDNAisoneofthemostinportantissuesintheprocessofdiscoveryanddevelopmentofdrugs.G-quadruplexisrichinguaninebasesofDNAwhichformedthroughthebondinginteractionoftheformationofthefourchainspiralstructure.Thisstructurecaninhibitthetelomeraseactivityeffectively,,andmakenormalcellapoptosis,soastoachieveantitumorpurpose.Inrecentyears,theG-quadruplextargetcancerdrugresearch.Thispaperisfocusedonthesynthesisofcomplexes,usingtheultraviolettitrationandfluorescencetitrationmethodtostudythestabilityofexistingmetalrutheniumcomplexestoG-quadruplexandDNA'sidentificationtothespecificityofthemetalions.【Keywords】Pt(II)complexes,G-quadruplex,DNA,Ru(II)complexes

目錄1引言 31.1基于順鉑抗癌藥物的研究意義 31.2金屬鉑抗癌藥物的發(fā)展 31.3核酸的組成與結(jié)構(gòu) 31.3.1概述1.3.2DNA結(jié)構(gòu)1.4G-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系1.4.1G-四鏈體1.4.2G-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系1.5本文所作的工作 32理論部分 42.1DNA與配合物作用的研究方法 42.2各種生成函數(shù)法的測(cè)定原理 42.2.1光譜學(xué)方法 42.2.2流體力學(xué)方法 42.2.3密度泛函計(jì)算與分子模擬 43實(shí)驗(yàn)部分 53.1引言 53.2藥品和儀器 53.2.1實(shí)驗(yàn)試劑 53.2.2實(shí)驗(yàn)儀器 53.3配合物的合成及表征 53.2.1配體的合成3.2.2鉑配合物的合成3.4不同輔助配體的多吡啶配合物與G-四鏈體DNA的相互作用的研究3.4.1緩沖溶液的配制3.4.2配合物與DNA濃度的確定3.4.3.配合物與G-四鏈體相互作用的紫外——可見光譜滴定3.4.4配合物與G-四鏈體作用的熒光光譜滴定4結(jié)果和討論 64.1釕配合物與G四鏈體電子吸收光譜研究 74.2釕配合物對(duì)端粒G-四鏈體的選擇識(shí)別研究 75結(jié)論和展望 85.1結(jié)論 85.2展望 8參考文獻(xiàn) 9謝辭 101引言1.1金屬抗癌藥物的發(fā)展1965年Rosenberg偶然發(fā)現(xiàn)順二氯二氨合鉑(cis-[Pt(NH3)2Cl2],又稱順鉑)對(duì)大腸桿菌的分裂有抑制作用,并于1969年首次報(bào)道了順鉑具有很強(qiáng)的抗癌活性。1975年順鉑成為第一個(gè)用于臨床的金屬配合物抗癌藥物。從此以后,金屬藥物及其抗腫瘤機(jī)理成為人們關(guān)注的研究熱點(diǎn)?？墒琼樸K水溶性差,且僅能注射給藥,緩解期短,并伴有嚴(yán)重的腎、胃腸道毒性、耳毒性及神經(jīng)毒性,長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性。為此,人們開始展開對(duì)其它鉑系抗腫瘤藥物的研究,但結(jié)果并不理想。鉑系抗腫瘤藥物在臨床使用上具有毒副作用大以及耐藥性的問題,促使研究者積極尋找非鉑系抗腫瘤藥物。當(dāng)前非鉑系金屬抗腫瘤藥物研究主要集中在釕、銠、錫、鍺等金屬配合物,特別是釕配合物。作為鉑類配合物的對(duì)照物,釕配合物很早就被運(yùn)用于抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。與順鉑相較,釕配合物毒性相對(duì)較小,在生物體內(nèi)易于吸收,也易于代謝而且釕配合物有在腫瘤組織中發(fā)生聚集的特點(diǎn),能夠與DNA分子以共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵(靜電結(jié)合、溝面結(jié)合和插入結(jié)合)方式締合。從上世紀(jì)八十年代以來,釕配合物作為抗腫瘤藥物的研究已經(jīng)成為藥物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、配位化學(xué)以及生物無機(jī)化學(xué)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。1.2金屬鉑抗癌藥物的發(fā)展自1967年美國密執(zhí)安州立大學(xué)教授RosenbergB.和CampV.發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗癌活性以來,經(jīng)過30多年的發(fā)展,鉑類金屬抗癌藥物的合成應(yīng)用和研究得到了迅速的發(fā)展。順鉑、卡鉑的開發(fā)成功和臨床應(yīng)用給癌癥的治療帶來了一場(chǎng)新的革命。有數(shù)據(jù)表明,DNA鏈中許多相鄰的堿基間兩個(gè)氮原子距離為340pm,而順鉑中兩個(gè)氯原子間的距離為330pm,兩者恰好匹配,形成的鉑化DNA壽命較長(zhǎng)且不易被細(xì)胞蛋白如高移動(dòng)組(HMG)蛋白識(shí)別并修復(fù),因而將破壞腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制,抑制細(xì)胞分裂,最終殺死腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)在,順鉑和其它鉑化合物已顯示出它與病毒、細(xì)菌、寄生菌作斗爭(zhēng)的潛力。除此另外,鉑化合物也有希望用來診斷一些疾病。自從順鉑的抗癌活性被發(fā)現(xiàn)以來,鉑類抗癌藥物的研究和應(yīng)用得到了迅猛的發(fā)展。如今,順鉑和卡鉑已成為癌癥化療中不可缺少的藥物。1995年,世界衛(wèi)生組織對(duì)世界上近百種抗癌藥物進(jìn)行評(píng)價(jià),順鉑的療效、市場(chǎng)等綜合評(píng)價(jià)得分名列前茅。順鉑和卡鉑所獲得的成就極大地鼓舞了各國學(xué)者積極研究更好、更有效的鉑類抗癌新藥。當(dāng)前鉑類配合物的合成已歷經(jīng)三代。順鉑是第一代鉑類抗癌藥物(結(jié)構(gòu)如圖1.1所示),該藥的使用局限性是它的耐藥性及劑量毒性人體器官特別是對(duì)腎臟的損害較大。第二代鉑類配合物(結(jié)構(gòu)如圖1.2所示),其中以卡鉑為代表(結(jié)構(gòu)如圖1.2所示),其水溶性優(yōu)于順鉑,腎毒性低于順鉑,主要不良反應(yīng)為骨髓抑制。第三代鉑類代表化合物樂鉑(結(jié)構(gòu)如圖1.3所示),樂鉑全稱是環(huán)丁烷乳酸鹽二甲胺合鉑(Ⅱ),研究表明,該藥的抗腫瘤效果與順鉑、卡鉑的作用相當(dāng)或者更好,毒性作用與卡鉑相同,且與順鉑無交叉耐藥。圖1.1第一代主要鉑類抗癌藥物的結(jié)構(gòu)圖1.2第二代主要鉑類抗癌藥物的結(jié)構(gòu)圖1.3第三代鉑類抗癌藥物結(jié)構(gòu)當(dāng)前鉑類配合物研究的方向是:尋找比順鉑和卡鉑療效更好,不良反應(yīng)更小,藥學(xué)特性得到改進(jìn)的化合物、擴(kuò)大抗癌譜、開發(fā)與順鉑和卡鉑無交叉耐藥性的新型藥物。1.3核酸的組成與結(jié)構(gòu)1.3.1概述構(gòu)成生命物質(zhì)的兩類主要大分子是蛋白質(zhì)和核酸。核酸是由許多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物,廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi),與蛋白質(zhì)構(gòu)成生命物質(zhì)的兩類主要的大分子。生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。核酸是生物體的重要組成物質(zhì),在蛋白質(zhì)的生物合成上占重要位置,與生物的生長(zhǎng)、發(fā)育等正常生命活動(dòng)以及癌變、突變等異常生命活動(dòng)中起決定性的作用。因此,核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)之一。衰老和癌變是人類的兩大醫(yī)學(xué)難題,二者與端粒和端粒酶有密切關(guān)系。端粒是真核細(xì)胞染色體末端富含鳥嘌呤的DNA重復(fù)序列及一些結(jié)合蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)。端粒除了提供非轉(zhuǎn)錄DNA的緩沖物之外,還能保護(hù)染色體末端免于融合和退化,在染色體定位、復(fù)制、保護(hù)和控制細(xì)胞生長(zhǎng)及壽命方面具有重要作用,并與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生密切相關(guān)。在生理狀況下,隨著細(xì)胞分裂次數(shù)增加,端粒在復(fù)制分裂過程中將逐漸丟失堿基,從而使端粒漸進(jìn)性縮短。當(dāng)端?？s短至一定長(zhǎng)度時(shí)細(xì)胞將進(jìn)入生長(zhǎng)停止衰老死亡階段,即出現(xiàn)細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn),端粒酶能保證端麗的正常復(fù)制。除了胚胎組織、生殖細(xì)胞和少數(shù)造血肝細(xì)胞中具有端粒酶火星外,絕大多數(shù)體細(xì)胞中無端粒酶活性,可是,85%以上的腫瘤細(xì)胞端粒酶表示呈陽性。因此,以抑制端粒酶活性為目標(biāo)的腫瘤基因治療研究已成為一種新的藥物作用靶點(diǎn),而且極有希望成為最安全、有效的治療腫瘤的理想途徑。核酸是生物體內(nèi)的高分子化合物。單個(gè)核苷酸是由堿基、戊糖和磷酸三部分構(gòu)成的。根據(jù)所含戊糖的差異,核酸可分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類。核苷酸中的堿基分為嘌呤和嘧啶兩類。DNA主要由含腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷酸構(gòu)成。RNA主要由含腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核苷酸構(gòu)成。1.3.2DNA結(jié)構(gòu)DNA之因此能含有生物物種的所有遺傳信息,是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,每個(gè)人體細(xì)胞的DNA約含有100億個(gè)堿基。DNA分子的結(jié)構(gòu),有以下三種:第一,DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)。四種脫氧核糖核酸按照一定的順序,經(jīng)過3’-5’-磷酸二酯鍵連結(jié),由一個(gè)核苷酸的戊糖環(huán)第3’位羥基與另一個(gè)核苷酸的戊糖環(huán)第5’位的磷酸以酯鍵相連,具有一定的方向性。堿基間遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,即腺嘌呤(A)一定與胸腺嘧啶(T)配對(duì),鳥嘌呤(G)一定與胞嘧啶(C)配對(duì)。(如圖1-4)因?yàn)樗侵附M成核酸的核苷酸之間連鍵的性質(zhì)和排列的順序,因此DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)也被稱為DNA堿基序列。圖1-4核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)模型第二,DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。它是指磷酸和堿基按照一定順序排列時(shí),由于扭轉(zhuǎn)角度和各種堿基排列方式不同而產(chǎn)生各種各樣構(gòu)型的DNA。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種重要形式,它是指兩條脫氧多核苷酸鏈反向平行盤繞所形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由Watson和Crick兩位科學(xué)家于1953年提出來的一種結(jié)構(gòu)模型。在不同濕度和鹽濃度下,DNA的雙螺旋有著不同的構(gòu)象。DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分為兩大類:一類是右手螺旋,如A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA等;另一類是左手雙螺旋,如Z-DNA。雙鏈DNA的構(gòu)象與其核苷酸序列和堿基組成有密切關(guān)系。一般地,含隨機(jī)的堿基組成和序列的DNA雙螺旋分子一般只能形成A、B、C構(gòu)型;但嚴(yán)重重復(fù)的寡聚核苷酸則可形成其它的構(gòu)型,如D、E、Z和P構(gòu)型。改變一定的外界環(huán)境條件,如溫度、相對(duì)濕度、鹽的濃度以及有機(jī)溶劑等能夠使這些構(gòu)型進(jìn)行相互的轉(zhuǎn)化,而且這些轉(zhuǎn)變從本質(zhì)上都是改變核酸分子的內(nèi)在運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)的。圖1-5A-DNA、B-DNA和Z-DNA第三,DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)。它是指DNA中單鏈與雙鏈、雙鏈之間的相互作用形成的三鏈或四鏈結(jié)構(gòu),由DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲,包括線狀雙鏈中間可能有的扭結(jié)和超螺旋、多重螺旋及環(huán)狀DNA中諸如超螺旋和連環(huán)之類的各種拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)。在雙螺旋DNA的大溝中存在多余的氫鍵給體和受體,這些氫鍵給體和受體能夠和專一的結(jié)合分子(如蛋白質(zhì))發(fā)生相互作用,形成專一的復(fù)合物,也能夠與單鏈DNA分子結(jié)合形成三螺旋DNA。三螺旋DNA一般是由一條寡核苷酸鏈經(jīng)過與雙鏈DNA形成Hoogsteen鍵或反Hoogsteen鍵,在其大溝處緊密纏繞而成。三螺旋DNA的組成結(jié)構(gòu)基元是三堿基體,這些堿基體也具有專一性,具體體現(xiàn)在T、C、G、A分別要接在AT、GC、GC和AT堿基對(duì)上(見圖1-6)。形成三螺旋DNA的第三條鏈的抗酶括性、水溶性、脂溶性和毒副作用等因素直接影響其作為治療藥物的可能性。因而合成能抗核酸酶能力強(qiáng)、水溶性和脂溶性適當(dāng)、毒副作用小的寡聚核苷酸片段和提高三螺旋DNA穩(wěn)定性的主鏈修飾方法仍是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。圖1-6三螺旋DNA結(jié)構(gòu)1.4G-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系1.4.1G-四鏈體G-四鏈體(G-quadruplex)是一類特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu),在基因組中的一些鳥嘌呤富集區(qū)域,具有形成這一特殊結(jié)構(gòu)的傾向。這些區(qū)域包括端粒末端G重復(fù)序列,以及一些重要基因的啟動(dòng)子區(qū)域,因此G-四鏈體的形成或拆散可能涉及到體內(nèi)的一些重要生理過程的調(diào)控,比如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤形成等。另外,G-四鏈體結(jié)構(gòu)作為一種特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu),與普通雙鏈具有顯著的結(jié)構(gòu)差異,能夠成為藥物選擇性識(shí)別的靶點(diǎn)。因此,研發(fā)與G-四鏈體相互作用的小分子抗癌藥物受到了廣泛的關(guān)注。四鏈體結(jié)構(gòu)是由富含GDNA單鏈,在特定離子強(qiáng)度和pH值條件下,由單鏈之間或單鏈內(nèi)對(duì)應(yīng)的G殘基形成Hoogsteen堿基配對(duì),從而使四條或四段富GDNA單鏈旋聚成一段特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。由于富GDNA中的G殘基都是成串排列的,因此,當(dāng)四條或四段富G單鏈DNA的G殘基并肩形成Hoogsteen堿基配對(duì)時(shí),就形成了一個(gè)由4個(gè)G殘基的雜環(huán)平面聯(lián)合形成的G-quartet平面。在4條鏈中相應(yīng)的的G之間形成的四分體平面層層堆疊,就形成一段極其穩(wěn)定的四鏈體DNA結(jié)構(gòu)(見圖1-7)。由于這段四鏈體是以G殘基為主形成的,故稱為G-quadruplex。其中每個(gè)G堿基既是氫鍵的受體,又是氫鍵的給體,她們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上是等價(jià)的。在兩個(gè)相鄰的四堿基體的中央會(huì)形成一個(gè)空腔,空腔內(nèi)有負(fù)電性的羰基氧存在,使得此處易于結(jié)合陽離子。四鏈體四鏈體之間經(jīng)過π-π作用相互堆積結(jié)合在一起。G-quadruplex特殊結(jié)構(gòu)使得它能夠成為特異性的DNA靶點(diǎn)。圖1-7G-quadruplex結(jié)構(gòu)大量研究表明含不同G序列所形成的四螺旋結(jié)構(gòu)是不同的,即使是相同的序列也能夠按不同的方式進(jìn)行組裝。G-四鏈體DNA能夠經(jīng)過單鏈,雙鏈以及四鏈形成三種不同的四螺旋結(jié)構(gòu),每種結(jié)構(gòu)又有多種異構(gòu)體(見圖1-8)。大量研究表明含不同G序列所形成的四螺旋結(jié)構(gòu)是不同的,即使是相同的序列也能夠按不同的方式進(jìn)行組裝?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為經(jīng)過控制適當(dāng)?shù)臈l件,如溫度、DNA濃度、緩沖液中的Na+和K+的濃度等能夠改變G-四鏈體的構(gòu)型。圖1.8幾種典型的G-四鏈體結(jié)構(gòu)a:分子間四聚體結(jié)構(gòu)(平行);b:分子間二聚體鄰位發(fā)夾型結(jié)構(gòu)(反平行);c:分子內(nèi)椅狀結(jié)構(gòu)(反平行);d:分子內(nèi)藍(lán)狀結(jié)構(gòu)(反平行);e:分子內(nèi)螺旋槳狀結(jié)構(gòu)(平行);f:分子內(nèi)混合型結(jié)構(gòu)1.4.2G-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系端粒是由高度重復(fù)序列的端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白組成的復(fù)合物。20世紀(jì)三四十年代,HermannMuller和BarbaraMcClintock同時(shí)提出了端粒的概念。它是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu),能防止染色體DNA降解、末端融合、缺失及非正常重組維持染色體的完整和穩(wěn)定,并保證細(xì)胞正常分化。端粒的主體是雙螺旋結(jié)構(gòu),富GT鏈與富CA鏈配對(duì),但3’末端突出為一段單鏈懸掛。由于缺乏模板的引導(dǎo),染色體合成過程中傳統(tǒng)的DNA聚合酶就無法完全合成這個(gè)末端懸掛,從而造成端?？s短,這就是所謂的”末端復(fù)制問題”。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊的核蛋白復(fù)合體,由高度重復(fù)序列的端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白組成[17]。不同物種的端粒DNA序列存在差異,但都以富含鳥嘌呤(G)的重復(fù)序列為特征。人的端粒約有15kb重復(fù)串聯(lián)的TTAGGG構(gòu)成的,而且以50-200bp次分裂進(jìn)行縮短,主要組成部分為5-15kb長(zhǎng)的雙鏈DNA和3′末端100-200bp長(zhǎng)的G-單鏈懸垂(G-overhang)DNA。端粒的主體是雙螺旋結(jié)構(gòu),富GT鏈與富CA鏈配對(duì),但3′末端突出為一段單鏈懸掛。這段單鏈在名為Shelterin[18]Telosome[19]的蛋白結(jié)構(gòu)催化下折回到端粒內(nèi)部雙鏈,并將該端區(qū)域的一段自身鏈置換出來,取而代之與互補(bǔ)鏈配對(duì),形成T-loop(telomereloop)結(jié)構(gòu),而3’末端單鏈被”包埋”在T-loop中,端粒末端便形成了一個(gè)與外界隔絕的閉合結(jié)構(gòu)。正是由于這個(gè)閉合結(jié)構(gòu),端粒顯現(xiàn)出了對(duì)于染色體的穩(wěn)定及其基因組的完整非常重要的作用,它為染色體末端提供保護(hù)性,防止染色體互相融合、重組及一些外切酶、連接酶的作用,防止DNA的損傷,并計(jì)數(shù)在線性DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的末端DNA片斷的丟失。同時(shí),這種結(jié)構(gòu)也使端粒酶不可能持續(xù)與端粒3’末端單鏈發(fā)生作用,從而保證了端粒長(zhǎng)度的恒定。圖1.9左圖為人染色體末端的端粒DNA;右圖為人端粒結(jié)構(gòu)示意圖正常細(xì)胞的端粒隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行性縮短,在每一次的復(fù)制循環(huán)中端粒都要減少50-100個(gè)堿基對(duì),細(xì)胞在進(jìn)行大約50次分裂后就開始衰亡。端粒的長(zhǎng)短在細(xì)胞癌變和衰老中起著重要作用。而端粒的長(zhǎng)短可由端粒酶調(diào)節(jié)。1985年Greider和Blackburn首次從四膜蟲細(xì)胞提取液合成端粒的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)了端粒酶活性并同時(shí)證實(shí)了端粒酶具有維持端粒長(zhǎng)度的作用。端粒酶是一種核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物,它能以自身RNA為模板,將真核生物染色體末端端粒DNA加以延伸的酶,因此它又被稱為特化RNA依賴性DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、端粒末端轉(zhuǎn)移酶。端粒酶由三個(gè)部分組成,包括端粒酶RNA(+為中心的d-d躍遷所產(chǎn)生的配位躍遷光譜;2)配體至金屬或金屬離子(LMCT)或金屬離子至配體(MLCT)的電荷遷移光譜,簡(jiǎn)稱荷移光譜;3)以配體L為中心的配體間的電子轉(zhuǎn)移光譜(IL)。其中金屬離子向配體的電子躍遷發(fā)生在金屬離子具有充滿的或接近充滿的t2g軌道,而配體具有最低空Π軌道的配合物中。核酸分子由于其嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵體系,因此在紫外區(qū)260-290nm處有特征的吸收,這種吸收隨分子中各堿基的種類、所占比例以及堿基間的堆積方式等的改變而有所不同。一般來說,結(jié)構(gòu)越有序,吸收值越低。因此,我們可利用紫外吸收光譜對(duì)上述各核酸分子結(jié)構(gòu)的形成進(jìn)行初步判斷。當(dāng)配合物插入到DNA堿基對(duì)時(shí),對(duì)應(yīng)的吸收峰產(chǎn)生明顯的減色效應(yīng),并伴有一定程度的紅移。2.2.1.2熒光光譜熒光光譜法是研究小分子與核酸相互作用的主要手段。熒光物質(zhì)在激發(fā)光的激發(fā)下,由基態(tài)躍遷到較高的能級(jí)(激發(fā)態(tài))后,首先經(jīng)過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程消耗一部分能量,回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí),同時(shí)以光量子的形式發(fā)射能量,即為熒光。配合物以插入方式與DNA作用后,由于它的振動(dòng)模式受到抑制,或免受水分子的淬滅,配合物受到了DNA堿基疏水環(huán)境的保護(hù),其發(fā)光強(qiáng)度一般會(huì)增強(qiáng)。并根據(jù)強(qiáng)度的變化來判斷與DNA作用的強(qiáng)弱。2.2.1.3圓二色譜及DNA解旋技術(shù)圓二色譜能夠檢測(cè)有無旋光物質(zhì)的存在[51,52],或比較左、右旋物質(zhì)的混合物中哪種含量更多,測(cè)定透析后的配合物的CD光譜,還可幫助確定配合物與DNA的相互作用有無異構(gòu)選擇性。G-四鏈體或I-motif結(jié)構(gòu)在圓二色譜中有著特殊的峰結(jié)構(gòu):平行型G-四鏈體在265nm附近有正的最大吸收峰,240nm附近有負(fù)的最大吸收峰;反平行型的G-四鏈體在295nm附近有最大正吸收峰,260nm有最大負(fù)吸收峰;混合式的G-四鏈體構(gòu)型則包括了290nm附近的正吸收以及特征的265nm附近的肩峰。加入配合物后,會(huì)使其吸收峰發(fā)生移動(dòng)并改變其強(qiáng)度,明顯影響G-四鏈體的CD光譜。這樣的一種現(xiàn)象便有了一定的選擇性變化,更容易區(qū)分G-四鏈體的構(gòu)型轉(zhuǎn)化,反應(yīng)配合物和DNA的結(jié)合模式。又由于CD光譜法靈敏度高,樣品在很低的濃度下就能夠檢測(cè)到特征吸收,圓二色譜成為一個(gè)很有效的檢測(cè)手段。利用圓二色譜儀同時(shí)能夠做熱變性的實(shí)驗(yàn)。DNA的變性指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。核酸由多鏈結(jié)構(gòu)(雙螺旋或四螺旋)變?yōu)閱捂溄Y(jié)構(gòu)的中點(diǎn)溫度反應(yīng)了該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,該溫度的變化也反應(yīng)了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化。配合物與DNA作用方式不同,則DNA熔化溫度(Tm)變化程度就不同。當(dāng)配合物與DNA以插入方式作用時(shí),DNA熔化溫度(Tm)變化最大。2.2.1.4其它光譜法線二色譜(LD)和電二色譜(ED):線二色譜和電二色譜都是采用與固定光軸方向(在流動(dòng)梯度體系中旋轉(zhuǎn)和外加電場(chǎng),使DNA螺旋軸取向固定)平行或垂直的平面偏振光,測(cè)量結(jié)合DNA后的配合物對(duì)垂直和平行于DNA的線偏振光的不同吸收。瞬時(shí)共振拉曼光譜:能夠探測(cè)微環(huán)境的變化對(duì)配合物激發(fā)態(tài)的性質(zhì)或行為的影響,從而能夠用來研究配合物與DNA的作用機(jī)理。2.2.2流體力學(xué)方法應(yīng)用流體力學(xué)技術(shù)測(cè)試DNA雙螺旋長(zhǎng)度變化。在確定小分子化合物與DNA作用模式方面,流體力學(xué)方法(如粘度[53],沉降速度及在凝膠中的泳動(dòng)速度等)有其獨(dú)特的應(yīng)用。2.2.3密度泛函計(jì)算與分子模擬密度泛函理論能夠很好地考慮到體系中電子的相對(duì)能量,特別適合于單線態(tài)金屬配合物的計(jì)算。由于密度泛函方法考慮了電子相關(guān),計(jì)算速度快,而且能有效地估算配合物的分子結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)及其與DNA相互作用的前線分子軌道,引起了理論化學(xué)家的注意。密度泛函理論的計(jì)算對(duì)于科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)新的功能獨(dú)特的配合物有著重要的理論指導(dǎo)意義。另外,還有pH滴定、熱力學(xué)方法和電化學(xué)方法等,不過這些方法在研究小分子化合物與DNA鍵合機(jī)理方面不太常見。

3實(shí)驗(yàn)部分3.1引言本章介紹了鉑多吡啶配合物的合成步驟,及其配合物的表征。在表征過程中特別是質(zhì)譜方面上,有些系列的配合物均與應(yīng)得的分子量有偏差,說明反應(yīng)過程中可能發(fā)生了其它的副反應(yīng),因此實(shí)驗(yàn)步驟還有待探索?，F(xiàn)列出實(shí)驗(yàn)步驟,以供參考、指正,預(yù)防此后的科研出現(xiàn)不必要的重復(fù)工作。本文設(shè)計(jì)合成得出了鉑配合物[(ptap)Pt(en)](PF6)2,經(jīng)過核磁、質(zhì)譜表征方法證明為此種配合物。3.2藥品和儀器3.1.1實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱純度級(jí)別生產(chǎn)廠家或提供商1,10-鄰菲咯啉AR國藥鹽酸羥胺AR國藥甲醇AR國藥氯仿AR國藥鈀碳催化劑AR國藥丙酮AR國藥乙醇AR國藥氫氧化鉀AR國藥濃硫酸AR國藥石油醚AR國藥氫氧化鈉AR國藥二甲基甲酰胺AR國藥乙二醇AR國藥四氯合鉑(Ⅱ)酸鉀AR國藥乙二胺AR國藥乙二醇AR國藥六氟磷酸銨98%阿拉丁乙醚AR國藥氯化鉀AR國藥氯化鈉AR國藥Tris堿AR國藥3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器核磁共振波譜Brucker400M核磁共振波譜儀記錄;電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)用LCMS-A型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;高純水用SZ97自動(dòng)三重蒸餾水發(fā)生器獲得;電子吸收光譜用LambdaBio40紫外分光光度計(jì)測(cè)量;熒光光譜用HitachiFP7000熒光光度計(jì)測(cè)量。3.2配合物的合成及表征3.2.1配體的合成1)5-硝基鄰菲羅啉的合成稱取鄰菲羅啉5g置于100mL圓底燒瓶,加入30mL濃硫酸,緩慢升溫至150℃,再逐滴加入15mL濃硝酸,反應(yīng)物繼續(xù)回流3小時(shí)后停止反應(yīng),冷卻至室溫,將反應(yīng)混合液傾入含500g冰的燒杯中,用事先配制好的NaOH溶液(50gNaOH溶于200mL左右蒸餾水)調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至接近中性(pH~5)。抽濾得淺黃色固體,用冰水洗滌三次以上,所得產(chǎn)物在50℃干燥后備用。產(chǎn)率87%。2)5-氨基-6-硝基鄰菲羅啉將4g(17.8mmol)5-硝基-6-氨基鄰菲羅啉溶于100mL無水乙醇并加熱回流,待反應(yīng)物全溶之后加入8g(118.9mmol)鹽酸羥胺,此時(shí)析出淺黃色懸浮固體,并在45分鐘之內(nèi),往上述混合液中滴加KOH的乙醇溶液(9gKOH溶于100mL無水乙醇),反應(yīng)混合物逐漸變?yōu)樽攸S色。繼續(xù)回流30分鐘后停止反應(yīng),冷卻至室溫后,將反應(yīng)液倒入300-600mL冰水中,靜置一夜后抽濾,濾餅分別用水、甲醇和氯仿洗滌后干燥,得產(chǎn)物1.6g產(chǎn)率35%。3)5,6-二氨基鄰菲羅啉將0.4g5-硝基-6-氨基鄰菲羅啉溶于400mL無水乙醇,加熱回流至全溶,再加0.2gPdC催化劑(10%Pd)攪拌混合均勻,并在15min之內(nèi)逐滴加入4mL水合肼(80%)。繼續(xù)回流1小時(shí)后停止反應(yīng),趁熱過濾,旋蒸濃縮濾液,再加入過量的石油醚后析出黃色固體,抽濾后用石油醚洗滌濾餅真空干燥。產(chǎn)率68%。4)雙呋喃基dpq-df的合成5,6-二氨基-1,10-鄰菲羅啉(0.25g,1.2mmol),2,2’-雙呋喃二酮(0.23g,1.2mmol),溶于20mLDMF置于100mL三頸瓶中,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流2天。反應(yīng)結(jié)束后,冷卻抽濾,所得固體用溫甲醇洗滌,干燥,產(chǎn)物黃綠色絮狀固體,凈重0.25g,產(chǎn)率57%。3.2.2鉑配合物的合成對(duì)于鉑配合物的合成,設(shè)計(jì)了如下一種,并對(duì)其進(jìn)行了合成。因時(shí)間關(guān)系,沒有對(duì)其進(jìn)行再次的純化。1)(dpq-df)PtCl2的合成將dpq-df0.1822g(0.5mmol)加入一圓底燒瓶中,向其中加入35mL乙二醇加熱近沸,全部溶解后,緩緩加入用5ml高純水溶解的0.2090g(0.5mmol)的K2PtCl4(梅紅色晶體),130oC加熱回流6小時(shí),出現(xiàn)紅棕色沉淀。將其自然冷卻至室溫,避光放置過夜。過濾,用水洗滌,去掉未反應(yīng)的K2PtCl4,然后用少量乙醇、乙醚洗滌并進(jìn)行干燥。最后得紅棕色粉末固體0.2432g,產(chǎn)率:77.15%。2)[(dpq-df)Pt(en)](PF6)2的合成將乙二胺240μL加入混有20mL乙二醇和0.2400g(dpq-df)PtCl2的圓底燒瓶中,加熱100oC回流3h,未全部溶解。待反應(yīng)完成后,加少量水稀釋,過濾出不溶物(為反應(yīng)的配體),向?yàn)V液中加入NH4PF6飽和溶液,產(chǎn)生沉淀,靜置一夜后,用慢速濾紙(因沉淀顆粒太小)兩層進(jìn)行過濾。用乙醇、乙醚洗滌干燥,得到咖啡色固體0.2804g,產(chǎn)率81%。3)[(dpq-df)Pt(en)](PF6)2的表征圖3-1[(dpq-df)Pt(en)](PF6)2的1HNMR譜圖4.2[(ptap)Pt(en)](PF6)2的質(zhì)譜示意圖3.3不同輔助配體的多吡啶配合物與G-四鏈體DNA的相互作用的研究3.3.1緩沖溶液的配制緩沖溶液用高純水配制緩沖溶液1:100mMKCl,10mMTris,pH=7緩沖溶液2:100mMNaCl,10mMTris,pH=73.3.2配合物與DNA濃度的確定3.3.2.1配合物濃度的確定配合物1:[Ru(bpy)2(dpqdf)]2+配合物2:[Ru(phen)2(dpqdf)]2+稱取一定質(zhì)量配合物分別用高純水和緩沖液1、2、3、4溶解3.3.2.2DNA的處理和濃度確定1)富G單鏈DNA取一定質(zhì)量富G單鏈DNA,溶于高純水,放入4℃冰箱保持24h,備用。濃度確定:用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA在260nm的吸光度值A(chǔ)260。摩爾消光系數(shù)為2.285×105m3cm-1,DNA濃度[DNA]=K×A2602.285×105(K是稀釋倍數(shù)),單位是mol?L-1。2)富G四螺旋DNA取兩份一定質(zhì)量富G單鏈DNA(核苷酸序列為5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'),分別溶于緩沖液1及緩沖溶液2中,緩沖溶液476uL,密封加熱到90℃,并保持5分鐘。然后自然冷卻到室溫,放入4℃冰箱中保持24小時(shí),備用。濃度確定:用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA在260nm的吸光度值A(chǔ)260。摩爾消光系數(shù)為2.285×105m3cm-1,取DNA50uL,再加入4950的緩沖液,稀釋倍數(shù)為100倍,DNA濃度[DNA]=K×A2602.285×105(K是稀釋倍數(shù)),單位是mol?L-1。3.2.2.3.配合物與G-四鏈體相互作用的紫外——可見光譜滴定在紫外-可見吸收光譜儀的雙光路系統(tǒng)中,先往參比池中加入475uL緩沖溶液做參比,基線穩(wěn)定后,往樣品池中加入濃度為10uM的配合物溶液25uL,用微量進(jìn)樣器每次往參比池和樣品池中加入5uL的DNA儲(chǔ)備液,混勻5min后,使DNA在配合物溶液中的濃度比值不斷增加,直至飽和。在200-800nm范圍內(nèi)檢測(cè)配合物的電子吸收光譜的變化。3.2.2.4配合物與G-四鏈體作用的熒光光譜滴定在樣品池中加入1950uL的緩沖溶液以及50uLDNA儲(chǔ)備液,測(cè)定溶液在620nm(440nm激發(fā))處發(fā)光強(qiáng)度,隨后樣品池中每次加入10uL濃度為200uM的配合物1、2溶液,用移液槍重復(fù)吸吐,混勻,5分鐘后檢測(cè)熒光情況,如此重復(fù),滴加10次。

4結(jié)果和討論4.1配合物與G四鏈體電子吸收光譜研究紫外光譜是研究小分子配合物與DNA相互作用的一種最簡(jiǎn)便、最常見的技術(shù)。價(jià)鍵理論認(rèn)為,每個(gè)分子都有一系列嚴(yán)格分立的能級(jí),處于低能級(jí)的分子受到光的能量激發(fā)時(shí),可吸收特征頻率的光子而躍遷到較高的能級(jí),進(jìn)而產(chǎn)生吸收光譜。許多小分子配合物本身在紫外可見光區(qū)有特征吸收峰,當(dāng)小分子配合物與DNA相互作用時(shí),一般會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的特征變化,表現(xiàn)為吸收譜帶變寬、吸收峰紅移(或藍(lán)移)及減色效應(yīng))。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生往往來源于小分子配合物發(fā)色團(tuán)與DNA堿基電子云的強(qiáng)烈相互作用。因此,紫外可見吸收光譜能夠用來研究小分子配合物與G-四鏈體DNA的相互作用,進(jìn)而根據(jù)其產(chǎn)生的相應(yīng)特征變化推測(cè)其作用模式。在紫外光譜圖中(圖4-1、4-2、4-3、4-4),300nm以下的吸收峰為配體間的Π-Π*躍遷峰(IL),而可見光區(qū)450nm附近的吸收峰為配合物的MLCT峰,能夠歸屬為Ru(dΠ)dpqdf(Π*)的躍遷吸收?？墒怯捎趦蓚€(gè)吸收峰所在波長(zhǎng)比較接近,因此在圖中只表現(xiàn)為一個(gè)寬的吸收帶。配合物與兩種端粒DNA作用后的LC峰和MLCT峰表現(xiàn)出了明顯的減色效應(yīng)和一定程度的紅移現(xiàn)象,因?yàn)镈NA在可見光區(qū)沒有吸收,推測(cè)配合物1、2在K+、Na+緩沖溶液環(huán)境中都能與G-四鏈體發(fā)生某種相互作用。同時(shí),一般認(rèn)為配合物與DNA作用時(shí),峰值減小并伴隨紅移,電子吸收值改變?cè)酱?則配合物與DNA作用越強(qiáng)。從圖中能夠看出,對(duì)于K+緩沖條件下,以MLCT峰看,配合物與DNA作用后的減色率比在Na+緩沖條件下的減色率大。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因可能是由于K+環(huán)境下形成的DNA微觀結(jié)構(gòu)更有利于其與配合物的鍵合。圖4-1鉀離子緩沖溶液配合物1與端粒G-quadruplex作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。圖4-2鈉離子緩沖溶液配合物1與端粒G-quadruplex作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。圖4-3鉀離子緩沖溶液配合物2與端粒G-quadruplex作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8μM)。圖4-4鈉離子緩沖溶液配合物2與端粒G-quadruplex作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8μM)。四種配合物在260-280nm附近出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰,在450nm附近出現(xiàn)較弱的的吸收峰,均可歸屬為配體中的Π-Π*躍遷,450nm附近的吸收峰對(duì)應(yīng)于金屬釕配位體電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)。從圖中顯示,隨著AG3(T2AG3)3濃度的逐漸增加,配合物在紫外區(qū)吸收光譜都能夠出現(xiàn)明顯減色現(xiàn)象和一定紅移,但MLCT峰的峰值與位移變化不大。以上信息表明配合物能夠與AG3(T2AG3)3的堿基發(fā)生強(qiáng)烈的Π-Π*作用。根據(jù)圖4-5、4-6、4-7、4-8,DNA滴定緩沖溶液450nm附近的吸收峰變化趨勢(shì)圖表明,DNA結(jié)合了釕配合物,保護(hù)了釕配合物的主配體,使得吸收峰減小。一般對(duì)于雙鏈DNA來說,當(dāng)配合物以插入方式進(jìn)入DNA的堿基對(duì)時(shí),與堿基對(duì)發(fā)生Π電子堆積效應(yīng),其Π*空軌道與堿基的Π電子軌道發(fā)生耦合,能級(jí)下降,從而導(dǎo)致Π-Π*躍遷能減小,產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。同時(shí),耦合后的Π軌道因部分填充電子,使Π-Π*躍遷幾率減小,產(chǎn)生減色效應(yīng)?？墒?對(duì)于插入劑結(jié)合到四鏈體里面的G-四分體之間是相當(dāng)困難的,不但僅是因?yàn)樗逆滙w是一個(gè)穩(wěn)定和剛性的結(jié)構(gòu),同時(shí)因?yàn)槠茐乃逆滙w的完整性需要耗費(fèi)很高的能量。因此,推測(cè)配合物1是經(jīng)過堆積到G-四鏈體末端的四分體與G-四鏈體作用的,即以外部堆積模式結(jié)合的。圖4-5DNA滴定鉀離子緩沖溶液配合物1在450nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。圖4-6DNA滴定鈉離子緩沖溶液配合物1在450nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。圖4-7DNA滴定鉀離子緩沖溶液配合物2在450nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。圖4-8DNA滴定鈉離子緩沖溶液配合物2在450nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。4.2釕配合物對(duì)端粒G-四鏈體與DNA作用強(qiáng)度的研究人類的端粒含有重復(fù)銜接的雙鏈DNA序列(5′-TTAGGG):(5′-CCCTAA)。這些重復(fù)序列的DNA可能形成特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。富G的鏈能在K+、Na+等陽離子誘導(dǎo)下形成由堆積的四分體組成經(jīng)過氫鍵穩(wěn)定的G-quadruplex結(jié)構(gòu)。G-四鏈體被認(rèn)為對(duì)體內(nèi)端粒酶延長(zhǎng)端粒具有負(fù)向調(diào)控作用。當(dāng)前,G-四鏈體被認(rèn)為是潛在的癌癥治療靶標(biāo)。一般認(rèn)為,多吡啶釕配合物與DNA結(jié)合后,如果出現(xiàn)熒光增強(qiáng)現(xiàn)象,說明配合物與DNA之間發(fā)生了某種方式的結(jié)合。熒光增強(qiáng)幅度的大小,基本上能夠反映出配合物與DNA作用的強(qiáng)弱。因此,我們也能夠根據(jù)作用強(qiáng)度差異表現(xiàn)出的熒光強(qiáng)度變化來識(shí)別不同種類的DNA。從圖4-9、4-10、4-11、4-12中能夠看出,DNA在鉀、鈉離子緩沖溶液中幾乎沒有發(fā)光。當(dāng)加入配合物1、2后,熒光顯著增強(qiáng),推測(cè)產(chǎn)生以上結(jié)果是由于G-四鏈體末端的四分體結(jié)構(gòu)便于平面芳香環(huán)堆積,因此熒光大幅增強(qiáng)。說明配合物與G-四鏈體的鍵合能力很強(qiáng)。因此能夠經(jīng)過觀察熒光強(qiáng)度的變化情況來識(shí)別特異性端粒結(jié)構(gòu),圖中變化情況還顯示K+環(huán)境下G-四鏈體的加入對(duì)配合物1,2的熒光強(qiáng)度影響大于Na+環(huán)境下的熒光強(qiáng)度變化。也說明K+緩沖環(huán)境對(duì)著兩種結(jié)構(gòu)識(shí)別區(qū)分效果更好,這可能是由于K+緩沖條件下形成的的G-四鏈體更有利于其與配合物的作用。圖4-9鉀離子緩沖液中,配合物1與G-quadruplex作用的熒光滴定曲線,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。圖4-10納離子緩沖液中,配合物1與G-quadruplex作用的熒光滴定曲線,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。圖4-11鉀離子緩沖液中,配合物2與G-quadruplex作用的熒光滴定曲線,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。圖4-12鈉離子緩沖液中,配合物2與G-quadruplex作用的熒光滴定曲線,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。根據(jù)圖4-13、4-14、4-15、4-16,由配合物滴定DNA鉀、鈉離子緩沖溶液,由于DNA是多齒配體,能夠與配合物進(jìn)行多方面結(jié)合,熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng),結(jié)合比大于一比一。圖4-13配合物1滴定DNA鉀離子緩沖溶液在600nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。圖4-14配合物1滴定DNA鈉離子緩沖溶液在600nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。圖4-15配合物2滴定DNA鉀離子緩沖溶液在600nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物2濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。圖4-16配合物2滴定DNA鈉離子緩沖溶液在600nm左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖,[Ru]=10uM,600nm左右的吸收峰變化是由于配合物2濃度的增加(從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。

5結(jié)論和展望5.1結(jié)論本文設(shè)計(jì)合成了一個(gè)鉑配合物,運(yùn)用兩種手段研究了釕配合物與端粒DNAG-四鏈體結(jié)構(gòu)的鍵合作用,得到了以下結(jié)論:(1)經(jīng)過核磁、質(zhì)譜表征方法證明首次合成了鉑配合物即[(ptap)Pt(en)](PF6)2,只是由于時(shí)間限制,沒有進(jìn)行再次提純。(2)紫外吸收光譜發(fā)生一定的增色效應(yīng),但變化幅度很小,釕配合物很有可能與DNAAG3(T2AG3)3的作用模式是外部堆積模式,又由于此DNA易形成G-四鏈體結(jié)構(gòu),因此發(fā)生的作用很可能為非特異性結(jié)合。有明顯的紅移現(xiàn)象也說明了,配合物和DNAAG3(T2AG3)3是有發(fā)生結(jié)合的。(3)配合物與DNA作用后的減色率比在Na+緩沖條件下的減色率大,可能是由于K+環(huán)境下形成的DNA微觀結(jié)構(gòu)更有利于其與配合物的鍵合。也說明K+緩沖環(huán)境對(duì)結(jié)構(gòu)識(shí)別效果更好,這可能是由于K+緩沖條件下形成的的G-四鏈體更有利于其與配合物的作用。(4)熒光大幅增強(qiáng)說明配合物與G-四鏈體的鍵合能力很強(qiáng),由于G-四鏈體末端的四分體結(jié)構(gòu)便于平面芳香環(huán)堆積,因此能夠經(jīng)過觀察熒光強(qiáng)度的變化情況來識(shí)別特異性端粒結(jié)構(gòu)。5.2展望端粒酶的活性與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化具有密切關(guān)系。本文的研究雖然取得了初步的成功,但依然任重道遠(yuǎn),尚有許多有待進(jìn)一步深入進(jìn)行的研究工作,這里擇其要者簡(jiǎn)要討論如下:(1)本文從現(xiàn)象上分析了兩種種多吡啶單核釕配合物與G-四鏈體的結(jié)合情況,下一步能夠?qū)⑨懚噙拎づ浜衔镒鳛槎肆-四鏈體分子開關(guān)的研究,以及運(yùn)用分子模擬等手段深入探究其與G-四鏈體具體的結(jié)合方式和結(jié)合位點(diǎn)。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn),研究配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒的抑制效果(3)本文說明[(ptap)Pt(en)](PF6)2的合成是可行的,下一步工作在于對(duì)其進(jìn)行提純,進(jìn)行分析師譚,探討其余G-四鏈體的作用機(jī)制。

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64.對(duì)中國中小企業(yè)信用管理的研究65.對(duì)中國中小企業(yè)創(chuàng)業(yè)版上市公司成長(zhǎng)性分析的探討66.對(duì)連鎖經(jīng)營企業(yè)資金運(yùn)行管理的思考67.推行全面預(yù)算管理

建立新型財(cái)務(wù)管理體系68.機(jī)會(huì)成本及其在企業(yè)財(cái)務(wù)管理中的應(yīng)用69.建立以預(yù)算管理為中心的財(cái)務(wù)管理模式70.論邊際成本在企業(yè)理財(cái)中的運(yùn)用71.企業(yè)融資障礙及對(duì)策研究72.高新技術(shù)企業(yè)財(cái)務(wù)管理若干問題的思考73.企業(yè)的擴(kuò)張與財(cái)務(wù)管理74.行為財(cái)務(wù)管理新論75.論破產(chǎn)企業(yè)財(cái)務(wù)管理存在的問題及對(duì)策76.企業(yè)核心能力與財(cái)務(wù)管理能力研究77.我區(qū)企業(yè)利用外資融資效率分析78.我區(qū)中小企業(yè)創(chuàng)新模式研究—基于財(cái)務(wù)視角79.企業(yè)集團(tuán)成本管理的創(chuàng)新問題研究80.集團(tuán)公司財(cái)務(wù)管理模式的探討81.非營利組織財(cái)務(wù)管理面臨的問題及對(duì)策研究82.企業(yè)激勵(lì)與績(jī)效評(píng)價(jià)問題研究83.我區(qū)企業(yè)集團(tuán)財(cái)務(wù)戰(zhàn)略選擇問題研究84.非營利組織財(cái)務(wù)管理創(chuàng)新問題研究85.企業(yè)集團(tuán)資本運(yùn)營問題研究86.論表內(nèi)融資與表外融資的關(guān)系87.EVA—現(xiàn)代企業(yè)的最佳績(jī)效評(píng)價(jià)指標(biāo)88.對(duì)杜邦分析法的再思考89.EVA與傳統(tǒng)業(yè)績(jī)?cè)u(píng)價(jià)方法結(jié)合問題研究90.財(cái)務(wù)分析指標(biāo)體系創(chuàng)新問題研究91.非財(cái)務(wù)分析法與財(cái)務(wù)分析法結(jié)合有效性研究92.非財(cái)務(wù)指標(biāo)在業(yè)績(jī)?cè)u(píng)價(jià)體系中運(yùn)用的有效性問題研究93.關(guān)于經(jīng)營者業(yè)績(jī)?cè)u(píng)價(jià)的思考94.企業(yè)融資效率實(shí)證研究95.信息時(shí)代財(cái)務(wù)控制趨勢(shì)分析96.期權(quán)在企業(yè)投資決策中的應(yīng)用97.企業(yè)集團(tuán)融資中的風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避問題研究98.我區(qū)企業(yè)的融資創(chuàng)新問題研究99.現(xiàn)代資本預(yù)算技術(shù)在企業(yè)理財(cái)中的運(yùn)用100.國有資本減持的財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)研究現(xiàn)在,我把自己多年來撰寫畢業(yè)論文經(jīng)驗(yàn),總結(jié)如下,一并贈(zèng)送給您,希望能幫到您:畢業(yè)論文注意事項(xiàng)前言畢業(yè)論文(學(xué)士學(xué)位論文)是本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)成果的”固化”與”濃縮”,其規(guī)范性歷來為指導(dǎo)教師和論文審閱人所重視,幾乎系評(píng)語中不可或缺之內(nèi)容。畢業(yè)論文的規(guī)范性由此可見一斑。各屆學(xué)生畢業(yè)論文中出現(xiàn)的問題比比皆是,筆者將其加以整理,匆匆成文,姑且稱之為”畢業(yè)論文注意事項(xiàng)”。須指出,本文全部?jī)?nèi)容乃筆者之見,難免以偏概全、掛一漏萬,更無權(quán)威性可言,故不敢稱之為”畢業(yè)論文寫作規(guī)范”。文中不當(dāng)之處在所難免,歡迎同仁批評(píng)指正,共同商榷,以饗畢業(yè)班之學(xué)生?；蛟S一些人認(rèn)為,給一篇畢業(yè)論文做”樣板”,諸多問題都將迎刃而解;網(wǎng)站上提供論文模版供學(xué)生下載更為上策。但筆者必須指出,許多應(yīng)注意的細(xì)微之處,遠(yuǎn)不是給一篇范文或給一個(gè)模版就能做到的,此乃撰本文之初衷。第一章關(guān)于插圖1．1圖號(hào)插圖要有圖號(hào),格式為”圖m-n”。其中m為該插圖所在的章號(hào),n為本章中該插圖的順序號(hào),m與n均為阿拉伯?dāng)?shù)字。每一章的插圖獨(dú)立編號(hào)。例如第3章的第4個(gè)插圖標(biāo)記為”圖3-4”1．2圖名(圖注)圖名應(yīng)確切反映該圖的含義,一般為名詞性短語,力圖簡(jiǎn)明扼要。圖名放于圖號(hào)后,與圖號(hào)隔兩個(gè)全角空格。為便于敘述,不妨將圖號(hào)與圖名并稱為”圖題”。1．3插圖的形式插圖一般有四種形式,即手繪圖、屏幕抓圖、掃描圖、文件插圖。來自電子版參考文獻(xiàn)的插圖,多數(shù)是模糊不清的,故建議用手繪圖取而代之。1．3．1手繪圖手繪圖系指在Word中直接用繪圖命令繪制的圖。該類插圖所占磁盤空間最少,系使用最多的一種插圖形式,數(shù)據(jù)流圖、結(jié)構(gòu)圖、程序框圖一般用此法繪制。繪圖所用圖例應(yīng)注意規(guī)范。程序框圖的選擇框要注意標(biāo)”是否”或”YN”,起始框、終結(jié)框注意用圓角矩形(建議使用專門用于畫框圖的軟件Visio畫框圖);數(shù)據(jù)流圖的數(shù)據(jù)線需標(biāo)數(shù)據(jù)名稱,數(shù)據(jù)加工與數(shù)據(jù)存儲(chǔ)之間的箭頭無數(shù)據(jù)名稱。其它圖形的圖例參考有關(guān)文獻(xiàn)。手繪圖時(shí)必須一絲不茍,搭結(jié)欠量、過量均不合格;圖中的文字放入文本框中,框內(nèi)文字注意橫縱居中;線框交界處注意勻稱;框內(nèi)文字的筆劃宜完整,不得被線框遮蓋;文字、線條不得交叉;圖中文字盡可能使用統(tǒng)一的字體、字形、字號(hào),其中字號(hào)原則上不大于正文字號(hào)(以小半號(hào)為宜)。微調(diào)線條位置、長(zhǎng)短時(shí),可將Alt鍵和箭頭鍵配合使用。觀察線條是否存在搭接問題時(shí),可選用500%的顯示比例,否則難以看出搭接問題。線條、文字等元素輸入完畢后,應(yīng)選中與所繪之圖有關(guān)的所有線條、文本框,按鼠標(biāo)右鍵,選”組合”,將各元素組合在一起。否則,很有可能排版后”東一只胳膊、西一條腿”,甚至”丟胳膊少腿”。1．3．2屏幕抓圖此類圖系指使用PrtScreen或Alt+PrtScreen鍵經(jīng)過剪貼板獲得的圖像。采用屏幕抓圖制作插圖時(shí),應(yīng)”量身定做”,抓圖后不要縮放,以免模糊。1．3．3掃描圖如使用掃描圖片,分辨率要求為300線,顏色模式為灰度,嵌入文中后不要縮放。1．3．4文件插圖文件插圖系指使用”插入|圖片|來自文件…”命令插入的圖像。采用文件插圖時(shí),盡量不要使用JPG等類型的壓縮圖片,以免影響打印效果。1．4插圖的位置盡量將插圖與正文中的相關(guān)文字說明置于同一頁。放入前一頁或后一頁,乃不得已而為之(例如圖太大等)。插圖一般居中放置;圖題位于插圖的下方,用宋體5號(hào)字,居中放置;圖題與插圖放于同一頁中,即兩者不得跨頁。換言之,圖題不能位于某一頁的頁首。一張圖一般不得跨頁(大的程序框圖例外,但需按正規(guī)要求標(biāo)清楚)。1．5插圖的排版插圖很小時(shí),建議使用環(huán)繞排版(四周排版),插圖前、圖題后均應(yīng)留適當(dāng)空間,切勿與正文”緊密相連”。第二章關(guān)于表格論文中的表格一般使用Word的表格功能直接制作,使用Excel制作亦可。2．1表號(hào)表格要有表號(hào),格式為”表m-n”。其中m為該表格所在的章號(hào),n為該章中該表格的順序號(hào),即每一章的表格獨(dú)立編號(hào)。例如第3章的第4個(gè)表格標(biāo)記為”表3-4”2．2表名表名應(yīng)確切反映該表的含義,一般為名詞性短語,力圖簡(jiǎn)明扼要。表名放于表號(hào)后,與表號(hào)隔兩個(gè)全角空格。為便于敘述,不妨將表號(hào)與表名并稱為”表題”。2．3表格盡量將表格與正文中的相關(guān)文字說明置于同一頁,放入前一頁或后一頁乃不得已而為之(例如表格太大等)。表格一般居中放置;表題位于表格的上方,用宋體5號(hào)字;居中放置;表題與表格放于同一頁中,即兩者不得跨頁。換言之,表題不能位于某一頁的頁尾。表格本身能夠跨頁,但次頁的表應(yīng)加一個(gè)表頭(注意,不是標(biāo)題,是表頭,即表格的首行),或在次頁首部加注”(續(xù)表)”。2．4表格內(nèi)文字的排版表格內(nèi)文字應(yīng)比正文小半號(hào),一般居中放置,但文字量較大且長(zhǎng)短不一時(shí),以左對(duì)齊為宜。表格設(shè)計(jì)應(yīng)美觀、大方,表格風(fēng)格盡量一致,推薦使用三線式表格。表格前、后均應(yīng)留適當(dāng)空間,切勿與正文”緊密相連”。第三章關(guān)于摘要5．1格式中英文摘要各占一頁,首行寫”摘要””ABSTRACT”(”摘要”之間空兩格,采用三號(hào)字、黑體、居中,與內(nèi)容空一行);第三行開始寫摘要內(nèi)容,首行空兩格(內(nèi)容采用小四號(hào)宋體)。最后單獨(dú)列一行,寫中英文關(guān)鍵詞。關(guān)鍵詞一般提供3-5個(gè)即可,寫于1-2行上,以分號(hào)分隔。中文關(guān)鍵詞前冠以”關(guān)鍵詞:”,靠左;英文關(guān)鍵詞前冠以”Keywords:”,亦靠左。第二行首個(gè)關(guān)鍵字與第一行的首個(gè)關(guān)鍵字對(duì)齊。具體要求參見模板。5．2內(nèi)容課題的意義,工作方法,結(jié)果與結(jié)論,后續(xù)研發(fā)建議等。摘要中不可大段大段地引用正文中的段落。切忌使用自動(dòng)翻譯工具將中文摘要翻譯為英文摘要。第四章關(guān)于目錄4．1目錄的制作目錄必須由Word自動(dòng)生成,不得手工輸入,以免后患無窮。制作方法:先使用格式工具欄的第一個(gè)圖標(biāo)將各級(jí)標(biāo)題”格式化”,再使用”插入|索引和目錄”便可自動(dòng)生成。目錄生成后,在首行加上”目錄”二字,采用黑體三號(hào)字,居中。目錄只列到三級(jí),一、二、三級(jí)標(biāo)題依次內(nèi)縮一字,分別采用四號(hào)、小四號(hào)、五號(hào)宋體。4．2目錄頁的位置目錄頁位于正文第一頁之前。正文首頁為論文第一頁。目錄右端的頁號(hào)應(yīng)對(duì)齊。目錄頁超過一頁時(shí),應(yīng)有頁碼,一般采用大寫羅馬數(shù)字,以區(qū)別于正文。注意:目錄之前的各頁均無頁號(hào)、無頁眉。第五章關(guān)于正文5．0關(guān)于頁面新的一章應(yīng)換頁。正文任何一頁的尾部均不得留很多空行(一章的末頁除外)。圖表過大,致使本頁剩余空間容納不下時(shí),可將其放于次頁,并將其后的文字上提至前一頁。編了號(hào)的圖表,原則上可放于正文的任何一頁,但一般與正文中的說明性文字不要相隔甚遠(yuǎn)。只有正文才有頁眉。換言之,正文之前的各頁無頁眉;自”參考文獻(xiàn)”起,以后各頁亦無頁眉。正文各頁的頁腳只有頁碼,且居中放置。5．1關(guān)于體例第一章章標(biāo)題(黑體、小三號(hào)、居中)1.1節(jié)標(biāo)題(黑體、四號(hào)、頂格)1.1.1小節(jié)標(biāo)題(黑體、四號(hào)、頂格)一、段落標(biāo)題1(宋體、小四號(hào)、空2格、用1.25倍行間距)1.段落標(biāo)題2(1)段落標(biāo)題3=1\*GB3①段落標(biāo)題4論文正文注意:無論哪一級(jí)標(biāo)題,尾部均無標(biāo)點(diǎn)符號(hào)。不得懸空出現(xiàn)一個(gè)標(biāo)題,如:系統(tǒng)的基本原理提示:根據(jù)往屆學(xué)生論文情況,各級(jí)序號(hào)盡量不用Word自動(dòng)生成,以免格式難以控制。5．2關(guān)于字體、字形、字號(hào)、行距、字距(按模版)正文一般用小四號(hào)宋體,行距采用1.5倍,字距采用默認(rèn)值。5．3關(guān)于分頁新的一章開始,要換頁,但不要用多個(gè)回車進(jìn)行分頁(否則后患無窮),而要用^Enter(即Ctrl+Enter)插入換頁符;標(biāo)題不得位于一頁的末行;圖題不得位于一頁的首行(前已提及,此處強(qiáng)調(diào));表題不得位于一頁的末行(前已提及,此處強(qiáng)調(diào));不能因圖表過大而提前換頁(即將大的圖表放入次頁);可將后頁的部分文字提到前頁來解決此問題。5．4關(guān)于文獻(xiàn)引用引用文獻(xiàn)處,用[n]以上角標(biāo)形式標(biāo)注,其中n為參考文獻(xiàn)序號(hào)。文獻(xiàn)引用屬正?，F(xiàn)象,無可厚非,但忌諱大量抄錄,特別是整章整節(jié)內(nèi)容大肆抄襲。軟件介紹、開發(fā)工具介紹、數(shù)據(jù)庫原理介紹宜少花筆墨。而且,所”寫”內(nèi)容出自何文獻(xiàn),需以此方法注明(通俗地講,抄自何處,應(yīng)讓人一目了然)。5．5關(guān)于圖表只要出現(xiàn)插圖或表格,在正文中必須要有相應(yīng)的說明。例如:”系統(tǒng)的數(shù)據(jù)流圖如圖3-1所示”,”數(shù)據(jù)字典示于表3-1”,等等(前已提及,此處強(qiáng)調(diào))。不得出現(xiàn)”…如下圖所示”、”…如下表所示”圖表中的文字應(yīng)注意嚴(yán)肅性,嚴(yán)禁出現(xiàn)不良人名、地名,忌諱影星、歌星名字或