臨床免疫定性試驗結(jié)果判讀泗陽縣人民醫(yī)院周育洋boatman7799@

今天的復習題1、簡述實驗室選擇免疫定性檢測敏感性、特異性、預測值、符合率的原則，并舉例說明。2、簡述丙肝抗體檢測實驗室診斷流程。3、簡述造成RPR試驗假陽性的一部分原因。本課件免疫定性試驗僅指臨床通常使用的基于抗原-抗體反應原理的試驗抗原-抗體反應的特點：*特異性*比例性前帶（抗體多）后帶（抗原多）*可逆性pH離子強度抗原抗體反應類型沉淀反應可溶性抗原凝集反應顆粒性抗原補體參于的反應中和反應標記免疫熒光放射

酶標發(fā)光金標

影響抗原-抗體反應的因素反應物自身的因素：抗原：可溶性顆粒性細菌細胞抗體：來源濃度特異性親和力反應環(huán)境條件：電解質(zhì)酸堿度溫度

原材料-決定性抗原類型：天然（自然生成，未經(jīng)修飾）變性（或在其它方面改變）合成（用片段和甚至是單獨的表位）純度：用于純化的方法應盡可能的精密。為了允許較小組分的檢測，應該有足夠的量亞型：全面性突變：抗原性改變影響因素原材料抗體類型：單克隆、混合單克隆、多克隆或單克隆-多克隆組合。非特異活性：可以來自“異?！比嗣庖咔虻鞍?，包括風濕因子和異嗜性抗體（抗-反芻類、抗-鳥類或抗-鼠類）。效價：最佳反應的工作稀釋度。推薦的稀釋度應該只作為起始點被接受。內(nèi)源性干擾因素

類風濕因子、補體、異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等。類風濕因子（RF）干擾RF一般為IgM型，亦有IgG和IgA型。RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點。在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現(xiàn)最為明顯，因為此時固相包被的抗體為抗人μ鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。類風濕因子干擾的排除稀釋標本改變標記抗體用變性IgG預先封閉標本中RF測抗原,可加入還原劑如2-巰基乙醇去除RF使用特異的雞抗體IgY作為標記或固相抗體補體干擾固相抗體和標記二抗的抗體分子可發(fā)生變構(gòu)，從而其Fc段的補體C1q結(jié)合位點被暴露出來，這樣C1q就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。固相抗體也會因為活化補體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力，而引起假陰性結(jié)果或結(jié)果偏低。

補體干擾的排除56℃30min加熱可使標本中補體C1q滅活使用特異的雞抗體IgY作為標記或固相抗體自身抗體干擾自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應靶抗原結(jié)合形成復合物，在免疫測定方法中可干擾相應抗原抗體的測定。為避免以上情況出現(xiàn)，可在測定前用理化方法將其解離。

影響因素--反應模式雙抗體（原）夾心法間接法競爭法競爭中和法捕獲法一步法的增強試劑聚乙二醇，用來增強抗原-抗體復合物的生成，加速非特異性綁定和反應時間，但可以引起非免疫化學沉淀，降低試驗的敏感性和特異性。液液相技術固液相技術二步法影響因素--信號放大系統(tǒng)顯色劑：OPD，TMB熒光：4-MUP時間分辨：稀土元素化學發(fā)光：魯米諾，吖啶酯類，AMPPD電化學發(fā)光：三甲基吡啶釕外源性干擾因素溶血、細菌污染、標本貯存時間過長、凝固不全、反復凍融。標本溶血注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白類似過氧化物的活性，使反應顯色。標本被細菌污染細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。細菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。

標本貯存時間過長標本在2～8℃下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法免疫測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性。血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在－70℃以下。

標本凝固不全血液采集后，離心分離血清沒有完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，易造成假陽性結(jié)果。血液標本采集后，應使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽１鶅霰４鏄吮颈苊夥磸蛢鋈诜磸蛢鋈谒a(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。幾個統(tǒng)計學概念

正態(tài)分布(Gaussiandistribution)當一質(zhì)控物用同一方法在不同的時間重復多次測定，且測定數(shù)據(jù)足夠多時，如以橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應測定值的個數(shù)，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學含義可用均數(shù)（X）、標準差（s）和概率來說明。重復性條件是指在短的間隔時間內(nèi)，在同一實驗室對相同的測定項目使用同一方法和同一儀器設備，由相同的操作者獲得獨立的測定結(jié)果的條件。診斷敏感性（sensitivityofdiagnosis）

是指將實際患病者正確地判斷為陽性（真陽性）的百分率。陽性預測值（positivepredictivevalue,PPV）

是指特定試驗方法測定得到的陽性結(jié)果中真陽性的比率診斷特異性（specificityofdiagnosis）

是指將實際無病者正確地判斷為陰性（真陰性）的百分率。陰性預示值(negativepredictivevalue,NPV)

是指特定試驗方法測定得到的陰性結(jié)果中真陰性的比率。診斷效率

（efficiencyofdiagnosis）是指能準確區(qū)分患者和非患者的能力。理想測定方法的診斷效率應為100%。臨床免疫檢測類型定量分析：確定被分析物的含量。產(chǎn)生一個與待測分析物的濃度相關的光譜信號，如果有已知濃度的分析物制劑做校準，分析物的實際濃度就可以被確定。定性分析只關注分析物的有或無，而不關心有多少（定量）。又分為用肉眼和經(jīng)驗判斷結(jié)果的純定性試驗和用讀數(shù)儀根據(jù)CUTOFF值或域值判定結(jié)果的量值化定性試驗。陽性結(jié)果只說明分析信號超過了分析閾值（檢測限）或cut-off值（cut-off值的設定給出了簡要的敏感性和特異性組合）。一般針對感染原和來自天然感染或免疫接種的相關抗體的相關檢測。定性免疫檢驗方法較多，主要有沉淀試驗、凝集試驗、熒光免疫試驗、酶免疫試驗和金標法。其中金標法雖然是靈敏、特異、快速、簡便、準確率較高的體外診斷方法。但是仍存在不足之處，易出現(xiàn)假陽性和假陰性，尤其是國產(chǎn)的金標試劑，所以建議采用ELISA法。定性免疫檢測的用途篩選試驗用來檢測全體人群或人群亞群一個特征的出現(xiàn)（如感染原或相關抗體的出現(xiàn)）。一般要求趨向二個極端：要么有高的臨床敏感性（即超過95%的臨床檢出率），檢測結(jié)果保證陰性篩選結(jié)果具有高可能性的沒有這些特征，而陽性結(jié)果可能需要做進一步的確證試驗；血站系統(tǒng)的傳染病篩查屬于此類。要么有高的特異性，檢測結(jié)果保證陽性篩選結(jié)果具有高可能性的具有這些特征。診斷試驗用來評價具有可疑給予特征（如一種感染的特殊類型）的人。敏感性和特異性應該處于相對平衡狀態(tài)。如果此特征對治療或預后考慮很重要，那么敏感性要盡可能的高；而且后續(xù)已有準確的確證試驗，可以不需要高的特異性。感染性疾病的大多數(shù)臨床試驗是用于診斷。

確證試驗

獲得篩選或診斷試驗陽性結(jié)果后，增加的試驗用于證明和確認此人前面的陽性結(jié)果。在這種情況下，主要考慮的性能常常是特異性和陽性預測值，而不是敏感性和陰性預測值；特異性應該超過98到99%。確證試驗可以是非免疫化學的（如，培養(yǎng)或脫氧核糖核酸研究）或免疫化學的（包括免疫印跡和抗原或抗體中和試驗）。如果篩選和診斷試驗已具有高的特異性和陽性預測值，則不需要確證試驗。定性免疫檢驗質(zhì)量控制

已知的弱陽性質(zhì)控:每次測定都應至少帶一個已知的弱陽性對照，從而有助于判斷臨床標本的檢測結(jié)果是否有效。陰性質(zhì)控:必需

每次測定都必須設空白對照、陰性對照、陽性對照和弱陽性對照。

CUTOFF值的選擇一個試驗一般不可能有完全的（100%）敏感性、特異性或預測值。Cutoff值的選擇和來自一個檢測的結(jié)果報告，應該考慮以下這些性能指標哪個更重要：（1）當疾病是嚴重并且可治療的，應該不能漏檢；假陽性結(jié)果不會導致嚴重的精神或經(jīng)濟創(chuàng)傷；不合適的治療僅有輕微的后果需要高敏感性。（2）當疾病是嚴重的但是不能治療；沒有疾病時具有心理或公眾健康價值；假陽性結(jié)果可能引起嚴重的精神或經(jīng)濟上的創(chuàng)傷（如HIV抗體的確證試驗）需要高特異性。（3）當不合適的治療可能導致嚴重后果，需要高預測值。（4）當疾病嚴重但是可治療，并且假陰性或假陽性結(jié)果同樣嚴重（如引起腦膜炎細菌抗原的分析）需要高符合率。在確定這些因素的合適平衡點時，廠商或其它檢測的研發(fā)者應該用來自三種人群的樣本評估檢測的性能：感染疾病的人，沒有疾病的健康人和非討論疾病患者的病人。廠商應該標明推薦的cut-off值是怎么定義的以及在什么樣的人群應用。理想狀態(tài)，實驗室應該在自己的服務人群中確定區(qū)間和cut-off值。純定性試驗的質(zhì)控要求

臨床免疫純定性試驗大都屬于CLIA’88豁免的技術（waivedtestingsites），包括免疫沉淀、凝集試驗、標記免疫的金標試紙和斑點滲濾、免疫熒光印跡法等等。對于FDA等批準家庭使用的技術，只要求檢測裝置有內(nèi)對照，檢測結(jié)果滿足說明書規(guī)定即可；對于需要經(jīng)驗來判定結(jié)果的技術仍需在實驗室進行，均有質(zhì)控的要求，但國際上無具體操作的規(guī)定和資料。根據(jù)顯色或發(fā)光直接判定陰陽性的技術，如金標試紙，美國CDC在“CLIA’88豁免的HIV抗體快速檢測的質(zhì)量保證指南<2007年版>”中要求：除檢測裝置的內(nèi)對照外，每檢測日或分析批，應使用弱陽性和陰性外對照作為質(zhì)控。無判定標準，一般理解為陰、陽性質(zhì)控的檢測結(jié)果分別為陰性和陽性即表明在控，相反則為失控。根據(jù)滴度或稀釋度判定陰陽性的技術，如凝集試驗，使用弱陽性和陰性外對照質(zhì)控，陽性質(zhì)控結(jié)果在均值上下一個滴度或稀釋度以及陰性質(zhì)控結(jié)果為陰性即為在控，否則視為失控。失控原因分析

失控信號的出現(xiàn)受多種因素的影響，包括質(zhì)控物、試劑、儀器、操作以及質(zhì)控規(guī)則本身等等。一旦出現(xiàn)失控信號，實驗室應該仔細地分析原因、查找根源，不要拘泥于推薦的程式化的步驟進行，而應該根據(jù)誤差的來源和當批工作的實際開展排查工作。偶然誤差造成的失控，首先考慮有無工作條件的變化，如新的質(zhì)控物、新的試劑、儀器故障、人員變動、操作程序變化等等；其次查找儀器校準、環(huán)境因素（水質(zhì)、溫濕度）等原因。系統(tǒng)誤差造成的失控，首先考慮質(zhì)控物或試劑原因，其次查找儀器校準問題，再次分析操作程序、環(huán)境因素等原因。失控處理

實驗室在確定失控原因后，應有針對性地采取糾正措施；對重復或系統(tǒng)性出現(xiàn)的失控原因需引入預防措施，必要時還應修改程序文件或作業(yè)指導書。對于失控批的患者標本應根據(jù)不同情況采取相應的重測方案：陽性失控，重測所有陰性標本；陰性失控，重測所有陽性標本。判讀實例（1）梅毒試驗的實驗室檢查TPTreponemapalidumsubsp.palidum蒼白密螺旋體蒼白亞種梅毒(syphilis)是一種疾病，我們只是做相關的實驗室檢查，對結(jié)果的解釋必須結(jié)合病史和患者的臨床情況。現(xiàn)實意義梅毒感染率逐年增加，2005年在所有甲乙類傳染病僅次于肺結(jié)核、乙型肝炎、痢疾、淋病居第五位。和艾滋病、淋病、肺結(jié)核等呈復合感染。梅毒感染率逐年增加，不容忽視假陽性率也很高陽性率：大樣本輸血員0.58%低危人群（病員）1.52%~1.61%

其中﹥50歲者占53.3%~62.3%陽性率3.02%~3.15%我們怎么應答：供血與受血者，手術，創(chuàng)傷性檢查，院內(nèi)感染控制。（婚檢）必查項目。實驗室診斷（病原體1）DFM暗視野顯微鏡找Tp：病灶組織液、腫大淋巴結(jié)穿刺液?！霻p呈白色發(fā)光，運動快速，開塞鉆樣旋轉(zhuǎn)?！靻未侮栃月剩?0%，多灶取樣，連續(xù)檢查?！熳⒁獍踩雷o。實驗室診斷（病原體2）DFAT直接熒光抗體檢查Tp：§病灶組織液、腫大淋巴結(jié)穿刺液。涂片、干燥、丙酮固定?！霧ITC─抗Tp單抗染色，熒光顯微鏡檢查?！熳⒁獍踩Ｗo。實驗室診斷（病原體3）PCR核酸檢查：敏感性差異大，不能區(qū)分T.pallidum亞種。已建立一些新方法（如MGB-TaqMan探針熒光定量PCR），需廣泛驗證。實驗室診斷（血清學）非密螺旋體抗體試驗（nontreponemalantibodytests,NTrAT）:測抗類脂抗體（反應素regain）。

其靶抗原是宿主細胞被螺旋體感染后釋放的類脂（lipoidal）物質(zhì)、螺旋體釋放的自身脂蛋白樣物質(zhì)（lipoprotein-likematerial）和心磷脂（cardiolipin）密螺旋體抗體試驗（treponemalantibodytests,TrAT）：測抗Tp特異抗體。其靶抗原是Tp的Nichols株的純化處理物。實驗室診斷（NTrAT）NTrAT：1）VDRL（venerealdiseaseresearchlaboratory）2）RPR（rapidplasmareagin）3）USR（unheatedserumreagin）4）TRUST（toluidineredunheated-serumtest）NTrAT：抗原為心磷脂、膽固醇、卵磷脂按適當比例配制的乙醇溶液1）VDRL：待測血清加熱滅活，顯微鏡觀察。2）USR：血清不加熱顯微鏡觀察。3）RPR：抗原染成黑色，血清不加熱，肉眼觀察。4）TRUST：抗原染成紅色，血清不加熱，肉眼觀察。實驗室診斷（TrAT）★TPHA（T.pallidumhemagglutinationassay）★TPPA（T.pllidumparticleagglutinationassay）★金標記免疫層析★ELISA-TP★FTA-ABS（fluorescentTp-antibodyabsorption）★FTA-ABS-DS（FTA-ABSdoublestaining）★免疫印跡試驗TrAT：抗原為梅毒螺旋體Nichols株特異抗原。（1）TPHA：Nichols株超聲或SDS提取抗原，包被甲醛、鞣酸處理的SRBC,遇血清中抗體血凝。血清用Reiter株，牛、羊RBC，正常兔血清和兔睪丸提取物吸收。（2）TPPA：染成紅色明膠顆粒包被抗原。試劑盒中未配吸收劑。（3）ELISA：純化或重組T.pallidum抗原（15000、17000、42000、47000）包被，間接法或雙抗原夾心法。未配吸收劑。

（4）FTA-ABS:Nichols株制片，丙酮固定，待測血清用含Reiter株吸收劑吸收。FITC-抗人IgG（IgM）示蹤。（5）FTA-ABS-DS：同上，第一次熒光染色用四甲基異硫氰酸羅達明標記的抗人IgG；第二次熒光染色用FITC標記抗Tp抗體。（6）免疫印跡（WB）：Nichols株純化抗原SDS，電轉(zhuǎn)印至NC膜或PVDF膜，待測血清不吸收，與膜上抗原反應，再與酶標抗人IgG反應，顯色。（7）金標記免疫層析：膜條上包被純化的Tp抗原，待測血清不吸收，與膜端金標抗人IgG結(jié)合后層析至測試區(qū)與Tp抗原結(jié)合，出現(xiàn)呈色條帶。梅毒血清學試驗敏感性與特異性試驗敏感性特異性一期二期潛伏三期VDRL78（74~87）10095（88~100）71（37~94）98（96~99）RPR86（77~100）10098（95~100）73（36~96）98（93~99）USR80（72~88）10095（88~100）─99TRUST85（77~86）10098（95~100）─99（98~99）NTrAT試驗敏感性特異性一期二期潛伏三期FTA-ABS84（70~100）1001009697（94~100）FTA-ABS-DS80（69~90）100100─98（97~100）TPHA76（69~90）10097（97~100）9499（98~100）TPPA80（86~100）100100─96（95~100）ELISA-IgG………………97（97~100）…………99（98~100）注：無分期資料TrAT梅毒實驗室檢查難點本屬包括4種對人致病和至少6種對人不致病的密螺旋體。Tp和其它該屬螺旋體在形態(tài)學上無法區(qū)別；核酸雜交試驗DNA同源性≧95%；已知的基因序列高度一致性；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及與某些單克隆抗體反應幾乎相同。因此，只能依靠對人和實驗動物的致病譜來加以區(qū)別。螺旋體的分類及致病性螺旋體種類

屬種疾病傳播方式或媒介Ⅰ疏螺旋體（Borrelia）伯氏疏螺旋體萊姆病硬蜱回歸熱螺旋體流行性回歸熱體虱赫姆疏螺旋體地方性回歸熱軟婢奮森疏螺旋體多種口腔感染條件致?、蚨搪菪w（Brachyspira）Ⅲ脊螺旋體（Cristispira）Ⅳ細絲體（Leptonema）Ⅴ鉤端螺旋體（Leptospira）問號鉤端螺旋體鉤端螺旋體病接觸疫水雙曲鉤端螺旋體Ⅵ小蛇形螺旋體（Serpulina）Ⅶ螺旋體（Spirochaeta）Ⅷ密螺旋體（Treponema）梅毒螺旋體梅毒性傳播雅司螺旋體雅司病皮膚損傷品他螺旋體品他病皮膚損傷地方性螺旋體地方性梅毒粘膜損傷

梅毒螺旋體結(jié)構(gòu)（1）長6~20μm,直徑90~180nm，有6~14個規(guī)則螺旋，兩端尖直。（2）外膜：有三層，含蛋白質(zhì)、類脂、糖，有抗原性，對溶菌酶抵抗，對脂溶劑、SDS敏感。（3）胞質(zhì)微絲：有外鞘及內(nèi)核心，含大量蛋白質(zhì)（4）菌體：圓柱形，包括細胞壁、胞質(zhì)膜、胞質(zhì)。（5）周質(zhì)鞭毛：附著于菌體兩端2~3條或4~6條。（6）基因組（Nichols株1.131×106bp，1998年）（7）抗原：特異性耐熱多糖抗原（多糖--RNA），非特異性心磷脂、類脂抗原，特異性不耐熱蛋白質(zhì)，包括MW（15.5~190.0×103）的16種，其中15500、17000、42000、47000有特異性。血清學試驗假陽性原因（一）其他的人類宿主相關螺旋體（1）口腔螺旋體（齒齦間隙牙菌斑）參與齒齦炎、牙周病。（2）皮膚相關螺旋體（外陰部皮脂腺分泌物）。（3）腸道螺旋體（結(jié)腸、直腸、糞便）參與腹瀉等腸病。

血清學試驗假陽性原因（二）

NTrATTrAT自身免疫病++瘧疾+-免疫接種+-皮膚病