第十四章DNA/蛋白質(zhì)測(cè)序儀?45歲，女性，乳腺癌，雙側(cè)?ER,PR陰性?HER-2陰性如何確定BRCA基因上的堿基排列？?確診為HOBC?對(duì)親屬進(jìn)行相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估CONTENTS01背景02DNA測(cè)序儀及其應(yīng)用03蛋白質(zhì)測(cè)序及其應(yīng)用目錄staticdynamicCONTENTS01DNA測(cè)序儀及其應(yīng)用02蛋白質(zhì)測(cè)序及其應(yīng)用目錄DNA測(cè)序的發(fā)展歷程DNA測(cè)序用于確定目標(biāo)DNA上片斷上的堿基排列順序；DNA測(cè)序是分子生物學(xué)過程一項(xiàng)非常重要的內(nèi)容，在疾病診斷、基礎(chǔ)研究的過程中起著非常重要的作用；人類基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)完成后，測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)。第一代測(cè)序以化學(xué)降解法和末端終止法，具有片段長(zhǎng)，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，代表公司ABI，貝克曼第二代測(cè)序目前應(yīng)用廣泛，通量高，代表公司Illumina以及ThermoFisher第三代測(cè)序以納米孔單分子測(cè)序技術(shù)為代表，無需要PCR第一代測(cè)序一、第一代測(cè)序技術(shù)測(cè)序

Sanger雙脫氧鏈末端終止法Maxam-Gilber化學(xué)降解法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、安全、快速、準(zhǔn)確OOO5’3’HO5’3’OH無3’OH的ddNTP阻止下一個(gè)dNTP的摻入ATACG退火延伸/終止變性DNA模板引物測(cè)序酶ddNTPdNTPsddNTP被加到正在合成的鏈上，由于它的3’-OH已被氧化，下一個(gè)dNTP的5’-磷酸基團(tuán)不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止測(cè)序反應(yīng)的延伸階段，ddNTP在不同位置摻入產(chǎn)生一系列不同長(zhǎng)度的新的DNA片段二、第一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)方法1電泳法2放射自顯影3熒光標(biāo)記法三、熒光標(biāo)記測(cè)序法熒光染料標(biāo)記法單色熒光標(biāo)記法多色熒光標(biāo)記法熒光標(biāo)記引物法熒光標(biāo)記終止底物法

熒光標(biāo)記引物法熒光標(biāo)記終止底物法

三、熒光標(biāo)記測(cè)序法ATACG退火延伸/終止變性DNA模板引物測(cè)序酶熒光標(biāo)記的ddNTPdNTPs四、熒光標(biāo)記底物法測(cè)序法確定一條染色體片斷上的堿基順序，是金標(biāo)準(zhǔn)。Sanger法：在PCR時(shí)加入熒光標(biāo)記的復(fù)制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應(yīng)于4種堿基）ddX的兩個(gè)作用：可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接毛細(xì)管電泳誰終止，堿基就是誰一種PCR技術(shù)PCR后產(chǎn)物的檢測(cè)儀器全自動(dòng)DNA測(cè)序儀平板型電泳的凝膠灌制在兩塊玻璃板中間，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又稱為超薄片層凝膠電泳毛細(xì)管電泳技術(shù)將凝膠高分子聚合物灌制于毛細(xì)管中（內(nèi)徑50

m～100

m），在高壓及較低濃度膠的條件下實(shí)現(xiàn)DNA片段的快速分離主流五、熒光標(biāo)記底物自動(dòng)測(cè)序儀31031303130xl35003500xl37303730x機(jī)分析軟件計(jì)算機(jī)耗材六、自動(dòng)測(cè)序儀的結(jié)構(gòu)AnodeBuffer(+)Pumpassembly(-)檢測(cè)區(qū)凝膠區(qū)塊自動(dòng)進(jìn)樣器高壓電源CCD

相機(jī)記錄所有通道信號(hào)激光激發(fā)所有通道計(jì)算機(jī)分析測(cè)序數(shù)據(jù)激光源毛細(xì)管電泳方向七、自動(dòng)測(cè)序儀的結(jié)果八、毛細(xì)管電泳型DNA測(cè)序儀的常見故障及維護(hù)電泳時(shí)儀器顯示無電流

電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細(xì)管電極彎曲而無法浸入緩沖液中毛細(xì)管未浸入緩沖液中毛細(xì)管內(nèi)有氣泡等

電極彎曲

安裝、調(diào)整或清洗電極后未進(jìn)行電極定標(biāo)操作就直接執(zhí)行電泳命令，電極不能準(zhǔn)確插入各管中運(yùn)行前未將樣品盤歸位、或雖然執(zhí)行了歸位操作，但X/Y軸歸位尚未結(jié)束就運(yùn)行Z軸歸位等電泳時(shí)產(chǎn)生電弧主要原因是電極、加熱板或自動(dòng)進(jìn)樣器上有灰塵沉積

其他

測(cè)序結(jié)束后應(yīng)將毛細(xì)管負(fù)極端浸在蒸餾水中，避免凝膠干燥而阻塞毛細(xì)管定期清洗泵塊定期更換電極緩沖液、洗滌液和廢液管

電泳時(shí)儀器顯示無電流

電泳緩沖液配制不正確電極導(dǎo)線未接好或損壞正極或負(fù)極鉑金絲斷裂正極或負(fù)極的膠面未浸入緩沖液中傳熱板粘住膠板主要原因?yàn)樯戏降木彌_液室漏液第二代測(cè)序之半導(dǎo)體測(cè)序法Multi-GeneWholeExomeWholeGenomeSingleGeneComplexitySangerSequencingNGSNGSNGS一、半導(dǎo)體測(cè)序法(IonTorrent測(cè)序)芯片上千萬個(gè)DNA片段同時(shí)讀取序列信息檢測(cè)流程復(fù)雜的生物信息學(xué)分析第二代測(cè)序之邊合成邊終止法CAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’

第一個(gè)堿基結(jié)合Cycle1:

檢測(cè)光信息切掉終止子和染料Cycle2-n:循環(huán)(Repeat)邊合成邊測(cè)序DNA

(0.1-1.0ug)

LibrarypreparationClustergeneration5’5’3’GTCAGTCAGTCACAGTCATCACCTAGCGTAGT123789456ImageacquisitionSequencingBasecallingT

G

C

T

A

C

G

A

T…ACGTASCIICharacterQ-scorePF(0,1)SequenceInstrumentRunIDLaneTileX-coordY-coordIndex#Read#LibraryPreparation制備文庫(kù)Sequencing測(cè)序

DataAnalysis數(shù)據(jù)分析43ClusterGeneration生成DNA簇21第三代測(cè)序-pacbio/huangshujia/p/3233693.html感染性疾病的分子診斷和研究遺傳性疾病的分子診斷和研究惡性腫瘤的分子診斷和研究在分子生物學(xué)其他領(lǐng)域的應(yīng)用CONTENTS01背景02DNA測(cè)序儀及其應(yīng)用03蛋白質(zhì)測(cè)序及其應(yīng)用目錄一、蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序儀蛋白質(zhì)順序指肽鏈中氨基酸的排列順序通常從左至右表示肽鏈從氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端）蛋白質(zhì)測(cè)序儀工作原理：執(zhí)行全自動(dòng)化的Edman化學(xué)降解反應(yīng)和游離氨基酸的分離與鑒定過程

多肽鏈N末端NH2＋PITC弱堿苯異硫甲氨酰肽

TFA

噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物＋剩余多肽

弱堿苯異硫甲氨酰肽

TFA

噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物＋剩余多肽PTH氨基酸

PTH氨基酸

HPLC

HPLC

二、蛋白質(zhì)測(cè)序儀的結(jié)構(gòu)及其各部件的功能測(cè)序反應(yīng)系統(tǒng)主要部件為反應(yīng)器

氨基酸分析系統(tǒng)由高效液相色譜毛細(xì)管層析柱組成

信息軟件處理系統(tǒng)根據(jù)氨基酸的層析峰來判斷為何種氨基酸三、蛋白質(zhì)測(cè)序儀的主要應(yīng)用新蛋白質(zhì)的鑒定在凝膠電泳中出現(xiàn)的未知條帶可以利用