人外周血淋巴細胞分離、計數(shù)、活力測定利用淋巴細胞分離液離心人外周血，根據(jù)單個核細胞不同的體積、形態(tài)和比重，將離心后呈密度梯度分布的單個核細胞分離出來。密度梯度離心法人外周血RBC、粒細胞比重為：1.092單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，比重為1.075因此選用一種比重介于二者之間而近于等滲的淋巴細胞分離液（比重為1.077±0.001）進行密度梯度離心，離心后不同比重的血細胞在分離液中呈梯度分布，從而分離出單個核細胞（淋巴細胞）

【實驗原理】淋巴細胞分離液組成：聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-hypaque）1．肝素溶液用生理鹽水將肝素配成125～250U/ml的溶液，置4℃下保存?zhèn)溆谩?．淋巴細胞分層液市售或自配，20℃時密度應為(1.077±0.001)g/L。3．Hanks液

pH7.2～7.4。4．完全RPMI-1640培養(yǎng)液。5．15ml或50ml錐底離心管。6．水平離心機，顯微鏡。7．玻璃吸管，滴管，細胞計數(shù)板等。8．2％臺盼藍染液?！緦嶒灢牧稀?/p>

1．采集靜脈血3ml，注入盛有肝素的無菌小瓶中（每ml全血加0.1ml肝素溶液），立即輕輕搖勻，使血液抗凝。

2．用吸管加入等量Hanks液，使血液等倍稀釋。

3．吸取淋巴細胞分離液2ml置于離心管中，然后將上述稀釋血液在距分離液界面上1cm處沿試管壁緩慢疊加至分離液表面。應注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)?！緦嶒灧椒ā?/p>

4．將離心管置水平式離心機內(nèi)，在18～20℃下，以2000r/min離心20min，離心后，管內(nèi)分層如下圖所示

5．用毛細吸管輕輕插入灰白細胞層，沿管壁輕輕吸出該層單個核細胞，轉(zhuǎn)入另一支離心管中。

6．將所得到的單個核細胞懸液用5倍體積的HanK’s洗滌2次，每次以1500r/min離心10min，棄上清。

7．混懸細胞，沉淀加1640培養(yǎng)液1ml，搖勻。

8．計數(shù)細胞：取0.1ml細胞懸液，加WBC稀釋液0.9ml，混勻，靜止片刻，沖池，低倍鏡下計數(shù)四大格細胞總數(shù)。實際細胞數(shù)/ml=Ⅹ×10×1000×10

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9．臺盼藍染液檢測細胞活力:取2滴細胞懸液于玻片，加2％臺盼藍染液1滴，混勻，鋪開，高倍鏡鏡檢。3min內(nèi)計數(shù)完100個細胞，計算存活細胞百分率：臺盼藍染液檢查活細胞不著色（無色），死細胞染成藍色。

肝素抗凝靜脈血3ml，輕搖勻↓

Hanks液稀釋靜脈血（加滿管），輕吹混勻↓

3ml淋巴細胞分層液中，疊加稀釋血液↓

水平離心，2000rpm/20min↓

吸取單個核細胞層（灰白層），移入新試管↓

Hanks液洗滌2次，1500rpm/10min↓

棄上清，加入16401ml混懸，搖勻↓

①計數(shù)，WBC稀釋液10倍稀釋0.1ml，1滴鏡下計數(shù)↓

②活力測定，2滴加1滴臺盼蘭混勻，3min內(nèi)鏡檢

【步驟】⒈淋巴細胞計數(shù)：正?！?×106/ml，青年人≥2×106/ml.⒉淋巴細胞活力測定：臺盼藍染液檢查活細胞不著色（無色），

死細胞染成藍色。計數(shù)100個細胞，計算活細胞百分率，一般活性≥95％。【實驗結(jié)果】

1．與血液樣品接觸時應注意安全防護，避免血源性傳染病傳染。

2．操作應輕柔，細胞懸液應充分混勻，避免損傷細胞活性及細胞丟失。

3．細胞分層液在室溫下應為(l.077±0.001)g/L；應避光4℃下保存，取出后逐漸升至室溫后混