內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定方法及其生物學(xué)特性

內(nèi)陸祖細(xì)胞（epcs）在肉芽組織形成、腫瘤血管生長、四肢和心肌缺血過程中形成新血管，促進(jìn)血液循環(huán)和傷口的恢復(fù)。目前,體外分離培養(yǎng)EPCs方法眾多,主要有差速貼壁篩選法、梯密度離心法、流式細(xì)胞儀分選法及免疫磁珠分選法等。梯密度離心法和差速貼壁篩選法操作簡便,費(fèi)用低,對儀器要求不高,但細(xì)胞純度相對較低。免疫磁珠法及流式細(xì)胞儀分選法能獲得純度較高的EPCs,但操作較為復(fù)雜,費(fèi)用也較高,對細(xì)胞有一定的損傷,分選獲得的細(xì)胞數(shù)量少,只能針對單一細(xì)胞表型,不能分選多種細(xì)胞表型的細(xì)胞群,絕對純化某一抗原陽性的EPCs必然會(huì)丟失另一部分來源的EPCs。此外,EPCs的誘導(dǎo)分化還需要特定的微環(huán)境,可能還需要許多生長因子,包括細(xì)胞之間通過接觸傳遞某種信號(hào)或分泌的某些因子。因此,本實(shí)驗(yàn)擬結(jié)合梯密度離心法與差速貼壁法分離大鼠骨髓單核細(xì)胞,然后使用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基EGM-2-MV-SingleQuots進(jìn)行體外培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增并鑒定,以期為構(gòu)建組織工程血管、創(chuàng)傷修復(fù)、血管新生提供EPCs種子細(xì)胞來源。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和sq1pe-小鼠、vegfr-2、sch3的抗凝劑、sq-射線pe-小鼠、c-ifSD大鼠40只,雄性,3~4周齡,體質(zhì)量(84.00±6.13)g,由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。EGM-2-MV-SingleQuots培養(yǎng)基,PE-小鼠抗CD34單克隆抗體,FITC-小鼠抗血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)單克隆抗體,FITC-小鼠抗CD133單克隆抗體,SW-CJ-IF凈化工作臺(tái),恒溫CO2培養(yǎng)箱,Olympus倒置相差顯微鏡,TCSSP2激光共振焦顯微鏡。1.2細(xì)胞培養(yǎng)和增殖采用頸椎脫臼法處死大鼠,置于75%乙醇浸泡消毒5~8min,無菌PBS溶液沖洗。在超凈臺(tái)上將大鼠固定于無菌解剖臺(tái)上,取下大鼠完整的股骨和肱骨,浸泡在含有PBS的培養(yǎng)皿中。剪開兩端骨骺皮質(zhì)層,顯露骨髓腔,用1mL注射器吸取PBS反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨質(zhì)呈白色,吹打均勻制成細(xì)胞懸液,吸管吸取,沿試管壁緩慢滴加于含等比例的淋巴細(xì)胞分離液液面上,2000r/min,離心30min。吸管吸出懸浮在上、中層界面處的中間云霧層(單核細(xì)胞層),置于另一個(gè)50mL離心管中,加5倍體積的PBS,混勻,1000r/min,離心10min。重復(fù)洗滌2次,棄上清,加入EGM-2-MV重懸細(xì)胞。混勻后計(jì)數(shù),以1×106/mL密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。48h后將上清液中未貼壁細(xì)胞移入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。分別觀察48h內(nèi)和48h后貼壁細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和增殖能力。待細(xì)胞融合約80%時(shí)傳代。傳代后計(jì)數(shù)上述兩組的平均細(xì)胞數(shù)。1.3細(xì)胞形態(tài)觀察從首次接種后24h開始,每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并采集圖像。1.4內(nèi)陸祖細(xì)胞的鑒定1.4.1細(xì)胞激活和凝集素1ficilact取第2代EPCs,胰酶消化后收集,調(diào)整單細(xì)胞懸液密度為105~106/mL,重懸于孔底部放有蓋玻片的6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片,培養(yǎng)3d;棄上清,PBS洗滌3次,每孔加入1mL培養(yǎng)基和2.5μLDil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h;2%低聚甲醛固定細(xì)胞20min,每孔再加入1mL培養(yǎng)基和10μLFITC-UEA-1(FITC標(biāo)記的凝集素-1),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h;取出細(xì)胞爬片,防粹滅劑中性樹脂封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察,采集圖像。顯示紅色熒光為吞噬了Dil-ac-LDL的EPCs,顯示綠色熒光為結(jié)合FITC-UEA-1的EPCs,雙染陽性為橙色熒光,為正在分化的EPCs。1.4.2熒光標(biāo)記檢測pe-cd33取第2代EPCs,用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為105~106/mL,分裝成3個(gè)EP管,第1管加入10μLPE-小鼠抗CD34單克隆抗體和10mLFITC-小鼠抗CD133單克隆抗體,第2管加入10μLPE-小鼠抗CD34單克隆抗體和10μLFITC-小鼠抗VEGFR-2單克隆抗體,第3管加入PE-小鼠IgG二抗作為同型對照。3管同時(shí)置于4℃避光孵育60min,PBS清洗2次,各管分別加入2%低聚甲醛500μL,固定45min,流式細(xì)胞儀檢測。以488nm氫離子綠光為激發(fā)波長檢測PE-CD34,以633nm氫離子紅光為激發(fā)波長檢測FITC-VEGFR2及FITC-CD133,每次計(jì)數(shù)5000個(gè)細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞的比例。陽性率=各抗體相應(yīng)象限數(shù)值-對照組相應(yīng)象限數(shù)值,每組設(shè)3個(gè)樣本,結(jié)果取平均值。1.4.3細(xì)胞收集分離取第2代EPCs,胰酶消化后收集制成單細(xì)胞懸液,1000r/min,離心5~7min,棄上清收集細(xì)胞;2.5%的戊二醛4℃固定過夜,用0.1mol/LPBS(pH=7.0)漂洗樣品2次,每次30min,1%鋨酸溶液4℃固定樣品30min,丙酮梯度脫水、浸透、包埋、超薄切片、鉛染色等步驟處理后,透射電鏡下觀察并采集圖像。2結(jié)果2.1第1代細(xì)胞增殖首次接種后24h內(nèi),單核細(xì)胞呈小圓形,懸浮在培養(yǎng)液中。48h內(nèi)貼壁細(xì)胞胞質(zhì)少,呈長梭形,細(xì)胞胞體較大,部分胞體融合,含有大量成纖維樣細(xì)胞,呈漩渦樣排列;經(jīng)傳代培養(yǎng)2次后,細(xì)胞形態(tài)以梭形為主,單層細(xì)胞融合成纖維樣結(jié)構(gòu)。48h后貼壁細(xì)胞以短梭形為主,也有三角形、多角形及紡錘形,培養(yǎng)7d后有明顯干細(xì)胞集落出現(xiàn),細(xì)胞胞質(zhì)多,胞核小,集落中間的細(xì)胞為圓形,周邊為梭形,呈出芽生長,這種結(jié)構(gòu)類似于血島,呈放射狀排列。平均每代生長周期為3~5d,細(xì)胞增殖至第6代未見明顯衰老。第6代以后,細(xì)胞開始逐漸接近于內(nèi)皮細(xì)胞,呈典型的鋪路卵石樣外觀,并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。見圖1。2.2dil-ac-ldl及胞膜的制備激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,EPCs胞質(zhì)攝取Dil-ac-LDL呈紅色,胞膜結(jié)合FITC-UEA-1呈綠色,雙染色陽性細(xì)胞呈橙黃色,為正在分化的EPCs。見圖2。2.3epcs陽性率結(jié)果見圖3,圖3a為加入小鼠IgG二抗作為同型對照組,雙陽性表達(dá)量極少,約1.1%。圖3b示第2代EPCs,CD34陽性率70.2%,CD133陽性率74.8%,雙陽性率69.3%。圖3c示第2代EPCs,CD34陽性率38.8%,VEGFR-2陽性率59.8%,雙陽性率39.2%。2.4胞器的檢測透射電鏡觀察結(jié)果顯示,EPCs表面有大量球狀、指狀或絨毛狀突起,胞質(zhì)內(nèi)含有大量細(xì)胞器,包括線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜小泡等,表明細(xì)胞代謝旺盛。此外,可見到內(nèi)皮細(xì)胞特征性細(xì)胞器———Weible-Palade(W-P)小體,呈桿狀,外附包膜,橫切面可見細(xì)桿呈漩渦狀排列,縱切面內(nèi)有大量平行的細(xì)管包埋于基質(zhì)中。見圖4。3討論3.1epcs的功能1997年Asahara等首次報(bào)道,人體外周血CD34+單核細(xì)胞可被動(dòng)員到血管損傷處,具有向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力,不僅在胚胎期參與血管生成,而且在出生后還參與新生血管的形成。EPCs存在于骨髓、胚胎組織及臍帶血中,以骨髓中的含量最高,且增殖能力強(qiáng)。骨髓單核細(xì)胞成分復(fù)雜,包括淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)中我們?nèi)?周齡的大鼠骨髓約1mL,經(jīng)過約4周培養(yǎng),可分離出足夠數(shù)量的內(nèi)皮祖細(xì)胞,細(xì)胞總數(shù)達(dá)106以上,能夠滿足后續(xù)研究的需要。3.2胎牛血清因子的培養(yǎng)在EPCs分離培養(yǎng)過程中,首先,掌握適當(dāng)?shù)膯魏思?xì)胞離心速度是關(guān)鍵。離心速度過快容易損傷細(xì)胞,細(xì)胞碎片增多,成活率降低,離心過慢則會(huì)使單核細(xì)胞與其他細(xì)胞相互混雜,細(xì)胞純度降低。本實(shí)驗(yàn)采用2000r/min,離心30min,能最大限度地提高細(xì)胞成活率及純度。其次,選用的培養(yǎng)基對EPCs至關(guān)重要。培養(yǎng)基中胎牛血清、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-1,人表皮生長因子均不可缺少。其中,胎牛血清的質(zhì)量及濃度非常重要,濃度最好選用5%~10%,<5%細(xì)胞攝取營養(yǎng)不足,生長緩慢,>10%則抑制細(xì)胞生長。然后,調(diào)整適當(dāng)?shù)膯魏思?xì)胞接種密度。干細(xì)胞的增殖與分化依賴于細(xì)胞之間的相互作用,適當(dāng)?shù)慕臃N密度有利于細(xì)胞間相互促進(jìn)生長,而不至于養(yǎng)分不足或產(chǎn)生接觸抑制。當(dāng)接種密度為105~106/cm2時(shí)細(xì)胞貼壁和分化最理想。此外,我們認(rèn)為采取半量換液要比全量換液更能促進(jìn)細(xì)胞生長,這說明細(xì)胞間可能分泌一些未知的細(xì)胞因子促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長與分化。最后,細(xì)胞的貼壁能力也極其重要。常用的促貼壁物質(zhì)有纖連蛋白、明膠等,前者可增強(qiáng)細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的粘連,通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的形態(tài),促進(jìn)細(xì)胞鋪展貼壁。但實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),使用提前包被纖連蛋白的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)EPCs,細(xì)胞貼壁太緊,消化傳代時(shí)胰酶使用量增加且作用時(shí)間延長,細(xì)胞的損傷增加,細(xì)胞的形態(tài)和生物特性均受影響。因此本實(shí)驗(yàn)未使用纖連蛋白預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶。3.3骨髓單核細(xì)胞的分離純化原代細(xì)胞主要通過形態(tài)學(xué)觀察、特異性細(xì)胞標(biāo)志、細(xì)胞功能等3方面進(jìn)行鑒定。目前對EPCs的鑒定還存在爭議,內(nèi)皮系標(biāo)志結(jié)合獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和功能特征,是當(dāng)前多數(shù)學(xué)者鑒定這一功能性細(xì)胞群的主要方法。(1)細(xì)胞形態(tài)觀察:我們在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),48h內(nèi)貼壁細(xì)胞在接種第3~5天,呈梭形甚至紡錘形散在分布于培養(yǎng)瓶底,第2~3周時(shí)出現(xiàn)生長高峰,第4周開始停止生長,并逐漸衰老死亡,這種細(xì)胞即早期EPCs;48h后貼壁細(xì)胞在傳代培養(yǎng)第2~4周時(shí)呈現(xiàn)典型的鋪路卵石樣表現(xiàn),第4~8周出現(xiàn)對數(shù)生長高峰,呈放射狀生長,出現(xiàn)干細(xì)胞集落,可存活12周,此即為晚期EPCs。早期48h內(nèi)貼壁細(xì)胞含有基質(zhì)干細(xì)胞、成熟內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和EPCs等細(xì)胞成分,而晚期貼壁細(xì)胞主要是我們所需要的EPCs。(2)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原鑒定:到目前為止,EPCs缺乏統(tǒng)一的細(xì)胞表面標(biāo)志,在細(xì)胞生長的不同階段,表面標(biāo)志也不相同。目前,普遍認(rèn)可CD34+、CD133+和VEGFR-2+等是內(nèi)皮祖細(xì)胞的主要表面標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,CD133+的表達(dá)在造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化過程中逐漸丟失,可見CD133是一種區(qū)分早期EPCs與晚期EPCs的標(biāo)志。在EPCs分化過程中,CD133表達(dá)逐漸降低,而CD34+的表達(dá)逐漸升高,并逐步開始表達(dá)成熟的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志,如VEGFR-2、VE-鈣黏蛋白和vWF,表明EPCs逐漸向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中CD133陽性率先逐漸上升,然后降低,正說明EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。(3)細(xì)胞的吞噬功能:除了EPCs,內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均可吞噬AC-LDL并結(jié)合UEA-1,所以熒光雙染法鑒定也并非完全特異。從功能角度進(jìn)行評估,激光共聚焦顯微鏡鑒定EPCs攝取Dil-acLDL,結(jié)合FITC-UEA-1的實(shí)驗(yàn),說明該細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞功能。實(shí)驗(yàn)中我們在透射電鏡下觀察EPCs內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特征性細(xì)胞器—Weible-Palade(W-P)小體,它是一種外有被膜的桿狀細(xì)胞器,存在于代謝旺盛的內(nèi)皮祖細(xì)胞中,它多出現(xiàn)在