季銨鹽型雙子表面活性劑對緩沖溶液中白蛋白的相互作用

表面活性劑與雙親性小分子物質之間的相互作用在食品、藥物和護理等領域具有重要意義。在生物化學研究中，十二烷基磺酸鈉-聚吡咯烷基膠體的電泳法確定了蛋白質的含量，這是兩者相互作用的成功應用。從模仿的角度來看，對蛋白質和表面活性劑之間的相互作用的研究提供了了解蛋白質和類脂化合物或構合物的結合的有價值模型。血清白蛋白是哺乳動物血漿中含量最豐富的蛋白質,它能夠儲存和轉運眾多的內源性和外源性物質.由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分離、提純而常被用作模型球蛋白[3~6]來研究其與表面活性劑、金屬離子或藥物分子之間的相互作用,以期在分子水平上揭示相關生命過程的奧秘.近年來有不少血清白蛋白-表面活性劑相互作用的研究報道,主要用差示掃描量熱、熒光光譜、等溫滴定量熱、圓二色法、光散射、核磁共振等方法研究了傳統(tǒng)型表面活性劑與血清白蛋白的相互作用[7~12].雙子表面活性劑(Gemini)分子中含有兩個親水基(離子或極性基團)和兩條疏水鏈,在其親水基或靠近親水基處,由聯(lián)接基團通過化學鍵聯(lián)接在一起.聯(lián)接基團的介入及其化學結構、聯(lián)接位置、剛性程度及鏈長等因素的變化,使Gemini的結構具備多樣化的特點,進而對其溶液和界面等性質產生影響,使之具備更加優(yōu)良的物理化學特性.因此,研究血清白蛋白與Gemini的結合規(guī)律可幫助人們更深入地了解親水-憎水等弱相互作用在生物大分子溶液中的重要性.等溫滴定量熱法(ITC)是近年來發(fā)展起來的一種在線和無損傷地研究生化熱力學和生化動力學的重要方法,特別適應于研究與蛋白質等生化大分子相關的各種熱力學過程[13~15].但迄今為止,應用該法研究表面活性劑與蛋白質的相互作用的報道不多[16~21].本工作用等溫滴定量熱法結合圓二色法技術研究人血清白蛋白與季銨鹽雙子表面活性劑的相互作用,測定其結合常數(shù)、結合位點數(shù)以及熱力學函數(shù)變化,并從微觀結構出發(fā)加以討論.重點考察了雙子表面活性劑疏水鏈長短對熱力學性質變化的影響.1實驗部分1.1n4-甲基-3-甲基苯磺酸酯h3的合成人血清白蛋白(HSA)購自Sigma公司,其溶液濃度用稱重法測定,所用分子量為66.5kDa.季銨鹽雙子表面活性劑[CnH2n+1(CH3)2NCH2CHOHCH2N(CH3)2CnH2n+1]Cl2(n=12,14),簡記為(CnN)2Cl2,參照文獻合成,在丙酮(AR)中重結晶提純至符合純度標準即水溶液的表面張力對表面活性劑的濃度曲線上不出現(xiàn)極小點.實驗用水為堿性高錳酸鉀存在下制備的二次蒸餾水.配制緩沖溶液(0.01mol·L-1,pH7.0)所用三羥甲基氨基甲烷和鹽酸均為分析純.1.2實驗方法和過程:關于蔗糖的標定和標定,hsa量熱實驗由納瓦級滴定式微量熱計(ThermalActivityMonitorTAM2277,瑞典ThermometricAB公司)完成,用隨機所帶Digitam4.1軟件控制實驗過程并進行數(shù)據(jù)采集和處理.通過測定蔗糖稀釋焓驗證,該量熱計的電標定精密度好于±1%.將表面活性劑(CnN)2Cl2溶液裝入250μLHamilton注射器,用612LundSyringePump注射泵,每次滴8.00μL于0.50mLHSA溶液中.滴定時間間隔足夠長(45min),以使信號返回基線.安瓿中攪拌器轉速固定在30r·min-1,待基線在攪拌下穩(wěn)定后啟動實驗,以使因攪拌而產生的熱量被自動扣除.實驗溫度為(298.15±0.01)K.為扣除(CnN)2Cl2和HSA的稀釋熱,分別進行(CnN)2Cl2溶液向緩沖溶液中滴定和緩沖溶液向HSA溶液中滴定的實驗.1.3級結構相對含量的測定HSA是光學活性物質,因此可測定它的圓二色(CD)譜,從而了解其構象.實驗所用儀器為JascoJ-810圓二色譜儀(Japan),光源系統(tǒng)用氮氣保護(流量為5L·min-1),樣品池的光徑為0.1cm.測量參數(shù):掃描速率100nm·min-1,分辨率0.1nm,響應時間1s,累積次數(shù)3次.掃描波段為190~250nm.HSA濃度為2μmol·L-1.實驗時向HSA中分別加入不同量的(C12N)2Cl2或(C14N)2Cl2,得到其CD譜,并用儀器附帶的楊氏法計算出二級結構相對含量.2結果與討論2.1級結構相對含量圖1a,1b分別是不同濃度的(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2與2μmol·L-1HSA結合后由圓二色譜儀測得的CD譜,表1則是計算出的二級結構相對含量.(C12N)2Cl2,(C14N)2-Cl2在190~250nm的波長范圍內沒出現(xiàn)任何CD信號,這表明觀察到的CD信號是由蛋白本身引起的.從表1可以看出,表面活性劑與蛋白質的結合作用會使蛋白質的二級結構發(fā)生變化,主要是α-螺旋向β-折疊的轉變,這樣會使構成α-螺旋的肽段伸展開來,轉化為較為松散的二級結構,預測此過程應為焓變和熵變均增大的過程.2.2表面活性劑與hsa的結合力學2.2.1等溫滴定量熱dsc對于蛋白質和表面活性劑之間的結合反應,其基本假設為一個蛋白質分子具有兩類結合位點,它們可結合相同的配體,并且同一類中的所有位點相同.此外,假定這兩類位點相互獨立,從而每一類位點上蛋白質與其配體的結合率彼此互不依賴.基于以上假定和Langmuir結合理論可得出:式中Ni(i=1或2)是第i類位點的結合位點數(shù),θi是第i類位點的結合率,Ki是第i類位點的結合常數(shù),cL,0和cP,0分別為配體L和蛋白質P的初始濃度,cL是配體L的游離濃度.將Eq.(1)代入Eq.(2)得:Eq.(3)是關于cL的一元三次方程,將其變形為:其中Eq.(4)有物理意義的根為其中ITC實驗中第j次注射所得到的熱量可表示為式中Vcell是微量熱計中安瓿的體積,?θi是從第j-1次注射到第j次注射第i類結合位點的結合率,?Hi(i=1或2)是第i類位點的結合焓.由Eqs.(3)~(9)可知在cL,0和cP,0已知的情況下,cL是關于Ni和Ki的函數(shù),所以Eq.(10)共含有K1,K2,?H1,?H2,1N和N26個未知量,由等溫滴定量熱數(shù)據(jù)利用MATLAB6.1軟件以Qj對cL,0進行非線性最小方差擬合,即可獲得上述六個熱力學參數(shù).2.2.2活性物質的結合位點模型見表2圖2a,圖3a分別是記錄得到的298.15K時(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2與HSA結合的ITC曲線,圖2b,圖3b分別表示由實測ITC曲線積分得到的結合反應熱對(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2)與蛋白物質的量之比的非線性擬合曲線.由圖可見,這兩種表面活性劑與HSA的結合均由最初的吸熱反應轉化為放熱反應(轉化時表面活性劑對HSA的物質的量之比(C12N)2Cl2約為24∶1,(C14N)2Cl2約為42∶1),這與文獻中關于陽離子表面活性劑(DTAB)與牛血清白蛋白(BSA)結合的ITC曲線中所得能量轉化趨勢基本一致.由圖2b和圖3b中的曲線擬合程度可以看出,用兩類結合位點模型可精確地模擬本文雙子表面活性劑與HSA的結合,這兩類結合位點分別對應:(1)表面活性劑帶正電荷的極性基團與蛋白分子表面的氨基酸殘基的靜電相互作用,(2)表面活性劑的憎水基團與蛋白分子疏水空腔的疏水相互作用由表2數(shù)據(jù)可見,兩類結合位點分別為強結合位點(高的K值)和弱結合位點(低的K值),且對應(C14N)2Cl2的相應K值均比(C12N)2Cl2有所增加,這表明(C14N)2Cl2與HSA的結合力比(C12N)2Cl2與HSA的結合力增強.值得注意的是,(C14N)2Cl2與HSA結合的弱結合位點數(shù)(4.5)遠遠小于(C12N)2Cl2與HSA結合的弱結合位點數(shù)(49.4),這很可能是盡管表面活性劑的疏水鏈較長時可以自卷曲,但由于HSA的疏水性空腔容積有限,而(C14N)2Cl2的疏水鏈過長,因此只有部分進入疏水空腔內,從而導致弱結合平衡位點數(shù)的明顯減小.同樣由于這個原因,使(C14N)2Cl2的極性基團與蛋白分子表面氨基酸殘基的結合幾率增大,導致其強結合位點數(shù)比(C12N)2Cl2有所增加.2.2.3探索c4d-l-2c2的實驗結果由表2數(shù)據(jù)可見,強結合位點的焓變?H1均為正值且對應(C14N)2Cl2的?H1比(C12N)2Cl2更正;而弱結合位點的焓變?H2均為負值,且對應(C14N)2Cl2的?H2比(C12N)2-Cl2負值減小.這是由憎水相互作用,水分子由疏水空腔向本體相的轉移,表面活性劑憎水鏈周圍“冰山結構”的破壞及靜電相互作用等因素共同決定的.(C12N)2Cl2與(C14N)2Cl2在樣品池中的濃度變化范圍分別為1.6×10-4~3.2×10-3和7.9×10-5~1.6×10-3mol·L-1,因此除前幾滴外,兩種表面活性劑在樣品池中的濃度均超過各自的臨界膠束濃度[(C12N)2Cl2:約7.8×10-4mol·L-1;(C14N)2Cl2:約1.4×10-4mol·L-1].所以,(CnN)2Cl2與HSA的作用涉及以下過程:(a)表面活性劑的解膠束;(b)表面活性劑膠束的稀釋;(c)HSA與單分子表面活性劑的作用;(d)HSA與表面活性劑膠束的作用;(e)HSA二級結構的變化.首先,由于在ITC實驗中進行了(CnN)2Cl2溶液向緩沖溶液中滴定的實驗,(a)和(b)過程中的熱效應在數(shù)據(jù)處理過程中均已被扣除.其次,在滴定過程中樣品池中的表面活性劑濃度大多數(shù)已超過各自的臨界膠束濃度,(c)過程的熱效應也可以忽略不計.因此熱效應主要是由于蛋白質與表面活性劑膠束的作用及蛋白質結構改變引起的.人血清白蛋白的等電點為4.7,所以在pH=7.0條件下,該蛋白分子表面帶負電,表面活性劑帶正電荷的極性基團與其相互作用應為放熱過程,但雙子表面活性劑帶正電荷的極性基團與蛋白分子表面的氨基酸殘基作用時,極性基團與蛋白分子表面的水化層結構均要遭到一定程度的破壞,此為吸熱過程.并且從上述CD數(shù)據(jù)分析出蛋白質二級結構會發(fā)生變化,這也是吸熱過程.從第一類結合位點的焓變?yōu)檎悼芍?水化層結構的破壞及蛋白質二級結構變化所需熱量超過靜電吸引作用的放熱量.由于(C14N)2Cl2的強結合位點數(shù)稍多,蛋白分子表面的水化層結構破壞程度要大些,所以對應(C14N)2Cl2的?H1比(C12N)2Cl2更正.弱結合位點主要是由于表面活性劑的疏水鏈與蛋白分子疏水空腔的疏水相互作用,當雙子表面活性劑的疏水鏈進入蛋白分子疏水空腔時,必與空腔內表面發(fā)生疏水相互作用導致放出熱量;同時,蛋白分子疏水空腔內的水分子被逐出到本體水相,該過程放出少量熱量,這就使放熱現(xiàn)象更明顯些.但同時原來圍繞在表面活性劑的疏水鏈周圍的“冰山結構”必被破壞,這是一個吸熱過程.從弱結合位點的?H2均為負值可知,疏水作用是弱結合位點的主要推動力.同時由于(C14N)2Cl2的疏水鏈過長,只有部分進入疏水空腔內,導致與疏水空腔內表面的疏水作用及“高能水”釋放所引起的放熱量均減小,這應是對應(C14N)2Cl2的?H2比(C12N)2Cl2負值減小的原因.2.2.4弱結合位點的熵變通過熱力學公式?G=?H-T?S和?G=-RTlnK可求出結合過程的吉布斯自由能變化和熵變(結果見表2).所求得的?G皆為絕對值較大的負值,表明所有的結合過程在本實驗條件下都是自發(fā)的.所有結合位點的熵變皆為正值.熵效應的這種變化是與主、客體的微觀結構和所處微觀環(huán)境密切相關的.強結合位點相應的熵變主要是由于表面活性劑的極性基團和蛋白分子表面水化層結構的破壞,以及蛋白質二級結構的變化.弱結合位點的熵變則主要有以下原因:首先,由于憎水鏈插入蛋白分子的疏水空腔內部,空腔內水分子被驅趕回本體水相.再者,隨著憎水鏈被疏水空腔包結,原來在其周圍的水分子形成的“冰山結構”崩潰,也會引起體系的熵變增大.(C14N)2Cl2的疏水鏈過長,只有少部分進入疏水空腔內,因此若只考慮上述兩種影響因素,對應(C14N)2Cl2的?S2應小于(C12N)2Cl2.但是,(C12N)2Cl2與蛋白的疏水空腔尺寸匹配,疏水空腔和(C12N)2Cl2之間的憎水作用使表面活性劑膠束的運動自由度大大減小從而對應(C12N)2Cl2的?S2減小.并且由于(C14N)2Cl2的疏水鏈有部分仍在疏水空腔外,具有較大的運動自由度,對應(C14N)2Cl2的?S2增大,正是上述多種弱相互作用的協(xié)同效應導致對應(C14N)2Cl2的?S2(91.99J·mol-1·K-1)比(C12N)2Cl2(29.10J·mol-1·K-1)大出許多.3強結合位點298.15K下,滴定式微量熱法對HSA與兩種季銨鹽雙子表面活性劑[(CnN)2Cl2,n=12,14]相互作用的研究表明,HSA對這兩種表面活性劑有兩類結合位點,一類是表面活性劑的極性基團和蛋白表面的氨基酸殘基之間的靜電作用造成的強結合位點(有較高的結合常數(shù)),此類結合為吸熱過程;另一類是表面活性劑的憎水基團與蛋白質疏水空腔的疏水相互作用造成的弱結合位點(有較低的