單劑量口服氟康唑制劑在健康人體的生物等效性研究

三氟乙醇是一種新型抗真菌藥物。它的抗菌譜與托康唑相似，但其抗菌活性比托康唑強(qiáng)。對(duì)真菌羊毛甾醇14α-脫甲基酶的抑制作用具有高度選擇性,即通過抑制麥角甾醇合成酶,使麥角甾醇合成受阻從而破壞真菌細(xì)胞壁的完整性,抑制其生長繁殖。對(duì)白色念珠菌、大小孢子菌、新型隱球菌、表皮癬菌及夾膜組織胞漿菌等均有強(qiáng)力抗菌活性。氟康唑具有吸收快、體內(nèi)分布廣、半衰期長、耐受性好、副作用小等特點(diǎn),臨床廣泛用于各種深部真菌感染性疾病及淺表、粘膜真菌感染的治療。材料、對(duì)象和方法1藥品、化學(xué)品受試制劑:氟康唑片,規(guī)格:每片150mg,批號(hào):070509;氟康唑膠囊,規(guī)格:每粒150mg,批號(hào):070604,均為廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn);參比制劑:氟康唑膠囊(商品名:大扶康),規(guī)格:每粒150mg,批號(hào):45892007,輝瑞制藥有限公司生產(chǎn);氟康唑?qū)φ掌?含量:99.9%,批號(hào):0070126;酮康唑?qū)φ掌?含量:99.5,批號(hào):061101,均中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇(色譜純),美國天地公司生產(chǎn);醋酸銨(分析純),沈陽化學(xué)試劑廠提供;乙酸乙酯(分析純),沈陽市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)試劑廠生產(chǎn);異丙醇(分析純),天津市博迪化工有限公司生產(chǎn);空白血漿,中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供;水為重蒸餾水。LC/MS儀,包括:LC-10ATvp液相色譜輸液泵、2010A型單重四極桿質(zhì)譜儀(APCI源)、SIL-HT型自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-MSSolution3.0數(shù)據(jù)采集系統(tǒng),日本島津公司產(chǎn)品;統(tǒng)計(jì)軟件3P97數(shù)據(jù)處理軟件,中國藥理學(xué)會(huì);TG-328A分析天平,上海天平儀器廠產(chǎn)品;CAY-1型液體快速混合器振蕩器,北京長安儀器廠產(chǎn)品;WM-2H型無油壓縮機(jī)蒸發(fā)儀,天津醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品;TDL-40B型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。2平均體質(zhì)量和禁含治療藥物的范圍18名健康男性受試者,平均年齡(22±0.6)歲;平均身高(171.7±3.7)cm;平均體質(zhì)量(64±5.9)kg。試驗(yàn)前,所有受試者經(jīng)體檢證實(shí),無胃腸道疾病,心、肝、腎功能正常。受試者在試驗(yàn)前1月內(nèi)停用一切藥品,從開始進(jìn)入試驗(yàn)后直到試驗(yàn)結(jié)束,禁煙酒、禁含咖啡因的飲料。對(duì)試驗(yàn)內(nèi)容及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)充分了解,試驗(yàn)前簽署知情同意書。3氟康唑膠囊組采用全排列組合,自身對(duì)照隨機(jī)三制劑、三周期、三交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。本試驗(yàn)方案經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。18名受試者按體質(zhì)量隨機(jī)編號(hào),分成3組,每組6名,分別于清晨7:00空腹給予受試制劑氟康唑片、氟康唑膠囊、及參比制劑氟康唑膠囊各600mg,以溫開水250mL送服,服藥后4h進(jìn)食低油脂的標(biāo)準(zhǔn)中餐,服藥后9h進(jìn)食低油脂的標(biāo)準(zhǔn)晚餐,交叉給藥時(shí),標(biāo)準(zhǔn)餐相同。2次試驗(yàn)間隔均定為2周。經(jīng)洗凈期1周后,交叉給藥。于服藥前(0h)和服藥后0.25、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0h由前臂靜脈取血5mL,置肝素抗凝管中搖勻,立即3000r·min-1離心10min,分離血漿,置于-20℃冷凍保存至分析。4血液中藥物濃度的測(cè)定4.1c7-3-預(yù)柱s1c3-1-3.2.2循環(huán)柱分析柱KromasilC18(150mm×4.6mm,5μm),預(yù)柱C18保護(hù)柱(10mm×4.6mm),購于大連中匯達(dá)公司;流動(dòng)相為甲醇-0.5mmol·L-1醋酸銨緩沖液-冰醋酸(75∶25∶0.02);流量:0.8mL·min-1;進(jìn)樣量2μL;柱溫為室溫。4.2熱塊溫度離子源為大氣壓化學(xué)電離源(APCI源);接口溫度為400℃;CDL溫度250℃;加熱塊溫度250℃;霧化氣(N2)流量2.5L·min-1;干燥氣(N2)流量:2.0L·min-1;檢測(cè)電壓1.4kV;正離子方式檢測(cè);掃描方式為選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM),用于定量分析的離子分別為m/z307.2(氟康唑)和m/z531.2(酮康唑)。4.3流動(dòng)相-內(nèi)酰胺5-t的制備取血漿100μL,加甲醇100μL,內(nèi)標(biāo)溶液50μL,渦旋混合3min,乙酸乙酯-異丙醇(95∶5)混合液3mL,渦旋3min,離心(4000r·min-1)5min,取上清液置另一試管中,氮?dú)饬飨麓蹈?殘?jiān)恿鲃?dòng)相200μL,超聲1min,渦旋1min,離心(12000r·min-1)3min,取上清液2μL進(jìn)樣。4.4模擬樣品測(cè)定取空白血漿100μL,加氟康唑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液100μL,制成相當(dāng)于氟康唑濃度為0.04、0.1、0.4、2.0、5.0、12μg·mL-1的模擬血漿樣品,按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下的方法操作,每一濃度進(jìn)行雙樣本分析,進(jìn)樣2μL,記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(w=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y=1.20×10-3X+1.46×10-2,γ=0.9995。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,氟康唑的線性范圍為0.04~12μg·mL-1,定量下限為0.04μg·mL-1。4.5定量分析方法氟康唑和酮康唑(內(nèi)標(biāo)物)離子化(APCI源),主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,分別為m/z307.2和m/z531.2,將2者作為定量分析時(shí)的監(jiān)測(cè)離子。在本色譜條件下,最低檢測(cè)限為0.02μg·mL-1(S/N≥3)。4.6回收率、精密度、準(zhǔn)確度方法回收率取空白血漿100μL,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下的方法,制備低、中、高3個(gè)濃度(氟康唑分別為0.1、2.0和10μg·mL-1)的模擬血漿樣品,每一濃度進(jìn)行6樣本分析。將所得峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得量,以測(cè)得量與添加量之比,計(jì)算得方法回收率分別為96.3%、97.2%和101.4%。提取回收率取空白血漿100μL,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下的方法,制備低、中、高3個(gè)濃度(氟康唑分別為0.1、2.0和10μg·mL-1)的模擬血漿樣品,每一濃度進(jìn)行6樣本分析。同時(shí),另取空白血漿100μL,除不加標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外,其他按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下的方法操作,殘?jiān)酉鄳?yīng)濃度的氟康唑和內(nèi)標(biāo)溶液分別為100、50μL,流動(dòng)相50μL溶解,進(jìn)樣分析,獲得相應(yīng)峰面積(3次測(cè)定的平均值)。以每一濃度2種處理方法的峰面積比值,計(jì)算得提取回收率分別為77.2%、81.8%和80.1%。4.7氟康唑測(cè)定法取空白血漿100μL,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限”項(xiàng)下的方法,制成高、中、低3個(gè)濃度(氟康唑濃度分別為0.1、2.0和10μg·mL-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每一濃度進(jìn)行6樣本分析,連續(xù)測(cè)定3天,根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度。根據(jù)QC樣品測(cè)定結(jié)果,計(jì)算精密度與準(zhǔn)確度,見表1。結(jié)果1氟康唑和酮康唑內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間b在本色譜條件下,取受試者的空白血漿100μL,按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下的方法操作(不加內(nèi)標(biāo)溶液),進(jìn)樣2μL;將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中,依同法操作;氟康唑和酮康唑(內(nèi)標(biāo)物)的保留時(shí)間分別為2.3、6.2min。取受試者口服給藥后的血漿樣品,同法操作,分別得色譜圖A、B,見圖1。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾血漿中氟康唑和酮康唑的測(cè)定。2平均血藥濃度—藥時(shí)曲線18名健康志愿者單次口服氟康唑膠囊(參比制劑和受試制劑)600mg后,平均血藥濃度—時(shí)間曲線見圖2,由圖2可見,氟康唑膠囊在健康人體內(nèi)的藥時(shí)變化規(guī)律符合一室模型。3生物利用度評(píng)價(jià)主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)用DASS2.0程序處理,將測(cè)得的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī),采用梯形法計(jì)算AUC0-t和AUC0-∞;以半對(duì)數(shù)作圖法,由消除相的濃度點(diǎn)計(jì)算ke和t1/2,tmax和Cmax采用實(shí)測(cè)值,見表2。將2種制劑的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞經(jīng)程序統(tǒng)計(jì)處理,求得氟康唑片的相對(duì)生物利用度為(103.4±5.4)%;氟康唑膠囊的相對(duì)生物利用度平均為(104.5±6.3)%,結(jié)果表明,受試制劑與參比制劑具有相同的生物效應(yīng)。提高靈敏度和準(zhǔn)確度本研究采用LC/MC法測(cè)定人血漿中氟康唑濃度,本方法在參考文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了改進(jìn)和創(chuàng)新,本方法簡便易行,特異性、重現(xiàn)行好,靈敏度較