少腹逐瘀湯對大鼠血液流變性及血小板聚集及凝血酶時間的影響

少腹部疾病的湯是清代王清仁的錯誤理論。當歸-川藥、川藥-芍藥、蒲黃-五靈脂、茴香-肉桂-干姜等藥物的組合。根據(jù)對該項目的初步研究，在大鼠急性血郁模型、外部血郁酶濃度和凝血酶時間等指標上，少腹部分散湯（sm）、全方減少浦黃-五靈脂（sm-pw）和蒲黃-五靈脂（pw）的活血化瘀作用中，闡明了蒲黃-五靈脂藥物在全身活血化瘀中的作用。1材料表面1.1凝血酶stg201鹽酸腎上腺素(Adr)注射液液,天津金耀氨基酸有限公司(批號0808231);枸櫞酸鈉,天津市生物化學制藥廠(批號20071107);凝血酶時間測定試劑盒(TT凍干品),凝血酶(批號STG10301-29),緩沖液(批號STG20302-29),凝血酶原時間測定試劑盒(PT干粉),北京世帝科學儀器公司;凝血活酶(批號STG10101041),緩沖液(批號STG20102-41),部分活化凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒(鞣花酸),上海太陽生物技術(shù)有限公司(批號312085);纖維蛋白原含量測定試劑盒(Clauss法),北京世帝科學儀器公司,FIB凝血酶(批號STG20401-26),咪唑緩沖液(批號STG300402-16)。ADP,北京中勤世帝科學儀器公司。1.2血液黏度測試方法Anke(TDL240B)離心機(上海安壽科學儀器廠);LG-R-80電腦血液黏度測試儀(北京世帝科學儀器公司);LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學儀器公司);ECL2010全自動電化學發(fā)光免疫分析儀。1.3繁殖場狀態(tài)雄性家兔,體重2~2.5kg,由南京江寧縣湯山青龍山動物繁殖場提供,許可證號:SCXK(蘇)2007-0008。SD雌性大鼠,體重(200±10)g,由南京醫(yī)科大學實驗動物中心(SPF級)提供(許可證號SCXK(蘇)2002-0031。1.4特芬材料少腹逐瘀湯組方藥材:當歸,川芎,赤芍,肉桂,小茴香,五靈脂,沒藥,蒲黃,延胡索,干姜均購于南京市藥業(yè)股份有限公司。2方法2.1樣品的制備2.1.1小炔香粉樣品sf稱取少腹逐瘀湯組方藥材(5.01kg),按照當歸:川芎:赤芍:蒲黃:五靈脂:肉桂:干姜:小茴香:延胡索:沒藥3∶2∶2∶3∶2∶1∶0.2∶0.5∶1∶2比例配比,加10倍量蒸餾水合煎兩次,每次1h,合并兩次濾液,5000r·min-1離心5min,60℃減壓濃縮干燥,得樣品1(SF)。2.1.2合規(guī)與合金的配比稱取全方減去蒲黃、五靈脂藥對藥材(3.51kg),相應(yīng)藥物配比同2.1.1,加10倍量蒸餾水合煎兩次,每次1h,合并兩次濾液,5000r·min-1離心5min,60℃減壓濃縮干燥,得樣品2(SF-PW)。2.1.3樣品溶液的制備稱取蒲黃、五靈脂藥對(2.0kg),按照少腹逐瘀湯中兩藥配比3∶2,加10倍量蒸餾水合煎兩次,每次1h,合并兩次濾液,5000r·min-1離心5min,60℃減壓濃縮干燥,得樣品3(PW)。2.2大急性血液抑郁癥模型的實驗2.2.1各組大鼠sccdr的模型建立選用健康清潔級SD雌性大鼠40只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按隨機數(shù)字表法將其分為5組,每組8只,即正常對照組、模型對照組、少腹逐瘀湯(SF)組、全方減蒲黃-五靈脂藥對(SF-PW)組和蒲黃-五靈脂藥對(PW)組。正常對照組常規(guī)飼養(yǎng),治療組每天按劑量(相當于臨床成人劑量的8倍)ig4mL/只,模型對照組每天給予同體積生理鹽水,連續(xù)7d。于第7天scAdr0.8mL·kg-1共2次,兩次間隔4h。在首次注射Adr后2h將大鼠浸入冰水(0~2℃)內(nèi)5min,處置后停食,次晨采血檢測。2.2.2全血黏度及血漿黏度檢測大鼠在10%水合氯醛麻醉下,頸動脈插管取血,枸櫞酸鈉(109mmol·L-1)1∶9抗凝,使用LG-R80電腦血液黏度測試儀測定全血黏度和血漿黏度,用溫氏管法測定血沉、血球壓積。血漿PT,APTT,TT,FIB測定按照試劑盒說明書進行。2.3adp誘導(dǎo)劑溶液制備新西蘭大耳白兔,雄性,10只,禁食8h后,戊巴比妥鈉麻醉,頸動脈插管放血,按枸櫞酸鈉(3.8%)1∶9抗凝,800r·min-1離心10min,取上層富血小板血漿(PRP),剩余部分3000r·min-1離心10min,取貧血小板血漿(PPP)。測試杯通道加入攪拌珠,加受試藥物10μL,再加250μLPRP。對照組加入等量溶解樣品溶液,溫育3min,放入測試通道,加10μLADP誘導(dǎo)劑,終濃度為5μmol·L-1。用PPP(加入與待測樣本相同的藥物10μL,消除藥物自身顏色影響)調(diào)零,對照組加入等量的溶解樣品溶液,用LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀測定血小板6min內(nèi)的最大聚集率,并按下述公式計算藥物對血小板聚集的抑制率。2.4凝血酶活性測定取新西蘭大耳白兔,雌雄各半,禁食8h后,戊巴比妥鈉麻醉,頸動脈插管放血,按枸櫞酸鈉(3.8%)1∶9抗凝,以3000r·min-1離心min,吸取上層,制備待測血漿。在測試杯每個通道中加入攪拌珠,加10μL不同濃度的藥物,再加待測血漿50μL,37℃預(yù)溫3min后,加入0.1mol·L-1的pH7.4TrisHCl緩沖液稀釋的15U·mL-1凝血酶溶液50μL,對照組加入等量的溶解樣品的溶液。用LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀測定凝血時間,并按下述公式計算藥物對血漿凝血時間延長率。3結(jié)果3.1大急性血液抑郁癥實驗3.1.1血藥濃度測量模型由表1可見,與空白對照組相比,模型組的全血黏度明顯升高(P<0.05),表明血瘀模型成立。與模型組相比,在高切變率時SF可以顯著降低全血黏度(P<0.05),其他切變率降低不明顯,且藥對有一定的降低全血黏度作用,SF-PW則沒有效果,說明PW對少腹逐瘀湯降低全血黏度起到主要作用。3.1.2sf-pw對血沉和紅細胞壓積的影響由表2可見,與正常對照組相比,模型對照組的血漿黏度、血沉明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,SF和PW對血沉有顯著性減低作用(P<0.05,P<0.01),并有一定的降低血漿黏度和紅細胞壓積作用,但作用不明顯,而SF-PW對血沉和紅細胞壓積幾乎沒有影響,說明PW對SF降低血沉和降低紅細胞壓積效應(yīng)起到主要作用。3.1.3sf對凝血酶時間和活化酶原時間的影響由表3可以看出,與空白對照組相比,模型對照組的凝血酶,部分活化酶原時間顯著縮短(P<0.05),纖維蛋白原含量明顯升高(P<0.05)。與模型對照組相比,SF可以顯著延長凝血酶時間(P<0.01)、凝血酶原時間(P<0.05)和部分活化酶原時間(P<0.05);PW可以顯著延長凝血酶時間(P<0.01)和部分活化酶原時間(P<0.05)而對凝血酶原時間沒有影響;SF-PW顯著延長凝血酶時間(P<0.01)、凝血酶原時間(P<0.05)和部分活化酶原時間(P<0.05)。說明PW在延長凝血酶時間和部分活化酶原時間與SF-PW產(chǎn)生增效作用。3.2sf抑制adp誘導(dǎo)的血小板聚集作用按照生藥量配比SF:SF-PW:PW為1∶0.7∶0.3將3組樣品各配成如圖所示3個濃度。由表4可以看出,SF抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用具有非常顯著性作用(P<0.01)。而PW組除大劑量組(44.50mg·ml-1)外,血小板聚集未呈現(xiàn)明顯影響,且SF-PW抑制效果要優(yōu)于該藥對,說明PW對于全方抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用無顯著性影響。3.3配制成圖15個濃度按照生藥量配比SF∶SF-PW∶PW為1∶0.7∶0.3將3組樣品各配成如圖所示的5個濃度。由表5可以看出,SF對凝血酶時間有顯著的延長作用(P<0.01),而PW也有顯著延長的作用(P<0.01),且優(yōu)于SF-PW,說明PW對全方體外延長凝血酶時間起到主要作用。4香港從《近效方》中作用結(jié)果表明急性血瘀大鼠全血黏度、血漿黏度、血沉、紅細胞壓積等均發(fā)生病理變化,證明該模型一定程度上體現(xiàn)了血瘀患者部分臨床表征。3種水提物對大鼠急性血瘀模型的效應(yīng)結(jié)果如下,全血黏度:SF>PW>SF-PW;血漿黏度:SF-PW>SF>PW;血沉:PW>SF>SF-PW;紅細胞積壓:PW>SF>SF-PW;TT:SF-PW>PW>SF;PT:SF-PW>SF>PW;APTT:SF>PW=SF-PW。3種水提物對家兔體外血小板聚集結(jié)果如下:SF>SF-PW>PW;對家兔體外凝血時間影響結(jié)果如下:PW>SF>SF-PW。說明蒲黃-五靈脂藥對對于全方降低全血黏度、血漿黏度,改善血沉以及體外延長家兔血漿凝血時間起到主要作用。蒲黃、五靈脂兩味藥組成的失笑散始載于《近效方》,具有活血行瘀、散結(jié)止痛的功效。該藥對又是諸多活血化瘀方劑的重要組成部分,在少腹逐瘀湯中該藥對用量達三分之一,其本身蒲黃中總黃酮類和有機酸類成分具有抑制ADP、花生四烯酸和膠原誘導(dǎo)的體內(nèi)外血小板聚集功能,其水煎液具有抑制血栓