植物組織培養(yǎng)技術(shù)及常見問題

20世紀(jì)初，德國植物生理學(xué)家哈布蘭特提出了等高植物器官和組織的可分為單一細(xì)胞的觀點(diǎn)，并考慮到植物細(xì)胞的全能性理論，即接近細(xì)胞的可能性。在無數(shù)科學(xué)家的努力下,至20世紀(jì)60年代,終于用不同實(shí)驗(yàn)證實(shí)了植物細(xì)胞全能性理論,即植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組,并具有發(fā)育成完整植物的潛在能力。在此理論基礎(chǔ)上植物組織培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生并得到迅速發(fā)展。但在組織培養(yǎng)過程中,常發(fā)生菌類污染、褐變和玻璃化現(xiàn)象三大難題,嚴(yán)重影響了組織培養(yǎng)材料的正常發(fā)育,給組織培養(yǎng)帶來了一定的困難。本文概述了植物組織培養(yǎng)技術(shù)及常見問題的解決措施。1利用人為控制環(huán)境條件生長植物組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論,將植物的離體器官(如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等)、組織(如花藥、胚珠、形成層、皮層、胚乳等)、細(xì)胞(如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞花粉等)以及去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體,在無菌條件下,經(jīng)過人為控制環(huán)境條件,培養(yǎng)在合成培養(yǎng)基上(含有營養(yǎng)物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等)對其進(jìn)行克隆,使其生長、分化并成長為完整植株的過程。2培養(yǎng)室的設(shè)置植物組織培養(yǎng)需要有準(zhǔn)備室、緩沖室、無菌操作室、培養(yǎng)室,另需要一定面積的試管苗馴化室、溫室或大棚。外植體在無菌接種室經(jīng)滅菌后,接種到無菌的培養(yǎng)基中;接種后的培養(yǎng)容器置放于可人工控制環(huán)境條件的培養(yǎng)室中,培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求進(jìn)行調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣等。3培訓(xùn)組織培訓(xùn)的操作過程3.1以生長新植株為原料的外植體技術(shù)再生植株用于進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的材料稱為外植體。外植體分為兩類,一類是帶芽的外植體,如莖尖、側(cè)芽、鱗芽、原球莖等。培養(yǎng)過程中可直接誘導(dǎo)叢生芽的產(chǎn)生。此類外植體獲得再生植株的成功率較高,變異性也較小,易保持母株的優(yōu)良性狀。另一類外植體主要是根、莖、葉等營養(yǎng)器官和花藥、花瓣、花軸、花萼、胚珠、果實(shí)等生殖器官。這一類外植體需要一個(gè)脫分化形成愈傷組織的過程,愈傷組織經(jīng)過再分化,形成叢生芽或產(chǎn)生胚狀體,然后誘導(dǎo)長根,形成完整再生植株。外植體的取用與植株年齡、組織部位、取材季節(jié)以及植株的生理狀態(tài)、質(zhì)量,都對培養(yǎng)時(shí)器官的分化有一定影響。一般處于年幼階段的實(shí)生苗比老齡的容易分化,生長的芽比休眠芽容易分化,頂芽比腋芽容易分化。3.2新培養(yǎng)基的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)測定植物生長需要,在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí),為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基,最好先選用一種已被廣泛采用的基本培養(yǎng)基(如MS或B5培養(yǎng)基)開始。當(dāng)通過一系列的實(shí)驗(yàn),對這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后,即有可能得到一種能滿足植物生長需要的新培養(yǎng)基。要嚴(yán)格按照培養(yǎng)基配方中的各成分比例及排列次序進(jìn)行配置,并用高壓滅菌鍋進(jìn)行徹底的滅菌。注意植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度對外植體的分化和增殖起到重要的作用,不同的植物種類對其濃度要求是有差別的,在實(shí)驗(yàn)中要對其做進(jìn)一步的改良和探討。3.3嚴(yán)格消毒處理植物組織培養(yǎng)能否取得成功的決定因素之一,就是保證培養(yǎng)物在無菌條件下生長。由于培養(yǎng)的植物材料大都采集于生長在自然環(huán)境下的植株,材料上常附有各種微生物,一旦被帶入營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,即會(huì)迅速繁殖滋長,造成污染,導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。所以培養(yǎng)前必須對外植體進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理,消毒的尺度以既能全都?xì)缤庵搀w上附帶的微生物,但又不傷害外植體的生活力為度。因此,必須正確選擇消毒劑種類和濃度、處理時(shí)間及操作程序。目前,常用的消毒劑有酒精、雙氧水、氯化汞、次氯酸鈣、次氯酸鈉等。具體消毒方法如莖尖、莖、葉片的消毒:(1)消毒前先用清水漂洗干凈或用軟毛刷將外植體上的塵埃刷除,茸毛較多的用皂液洗滌,然后再用流動(dòng)的清水洗去皂液,洗后用吸水紙吸干表面水分;(2)進(jìn)入無菌的接種室,用70%酒精浸泡外植體30-60秒鐘,(3)取出后馬上用0.1%-0.2%氯化汞消毒10-15min,或10%次氯酸鈣飽和上清液浸泡10-20min,或用2%-10%次氯酸鈉溶液浸泡6-15min。(4)消毒后用無菌水沖洗3-5次,用無菌紗布或無菌濾紙吸干水分后再接種。3.4光照強(qiáng)度及光照時(shí)間對植物生長的影響外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞,轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的過程。整個(gè)接種過程均需無菌操作。接種后的外植體放到培養(yǎng)室去培養(yǎng),普通培養(yǎng)室要求每日光照12-16h,光照強(qiáng)度為1000-3000lx,光照強(qiáng)度及光照時(shí)間依不同植物種類的不同生活習(xí)性而不同,應(yīng)注意設(shè)計(jì)對比試驗(yàn)得出適合的光照強(qiáng)度及光照時(shí)間;一般溫度控制在25±2℃,低于15℃或高于35℃對生長都不利;要求室內(nèi)保持70%-80%的相對濕度;為了解決氧氣問題,在液體培養(yǎng)時(shí)用震蕩培養(yǎng),固體培養(yǎng)時(shí)最好采用通氣性好的瓶蓋或瓶塞。4植物組織培養(yǎng)中的一些問題和解決措施4.1復(fù)配培養(yǎng)基的貯藏4.1.l配制大量元素母液時(shí),或者直接配置培養(yǎng)基時(shí)出現(xiàn)沉淀物可能是某些無機(jī)離子如Ca2+、SO2-4、Mg2+和PO2-4等在一起發(fā)生化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生不溶物。所以,母液配制或直接配置培養(yǎng)基時(shí)最好用純度高的重蒸餾水溶解,藥品采用純度較高的分析純,最好先用少量溫水將各種無機(jī)鹽類分別溶解后再按配方中所列的順序逐個(gè)倒入,邊倒邊攪拌;另外,鐵鹽也易發(fā)生沉淀,需單獨(dú)配置。4.1.2維生素母液中有菌類物質(zhì)存在維生素母液貯藏過程中,逐漸有白色菌類絮狀物出現(xiàn),而使維生素營養(yǎng)價(jià)值大大降低,影響培養(yǎng)物的正常生長發(fā)育。避免措施是:盡量縮短貯藏時(shí)間,最好在1-2個(gè)月內(nèi)用完;配制母液時(shí)用無菌蒸餾水配置,并貯藏在無菌的棕色試劑瓶中。4.1.3培養(yǎng)基滅菌前凝固,滅菌后不凝固現(xiàn)象一般培養(yǎng)基在高壓滅菌過程中,其中的某些成分在高壓環(huán)境下發(fā)生化學(xué)反應(yīng),致使培養(yǎng)基pH值向酸性一側(cè)偏移0.2-0.8,pH降低而使瓊脂凝固力下降,發(fā)生培養(yǎng)基滅菌前凝固,滅菌后不凝固現(xiàn)象。所以在調(diào)培養(yǎng)基的PH值時(shí),要高于培養(yǎng)基配方所要求的pH值0.2-0.5。一般的培養(yǎng)基要求為5.6-5.8,最好把pH值調(diào)到6.0左右;若需滅菌后再加入一定量的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì),可適當(dāng)增加瓊脂用量。4.2植物組的污染和預(yù)防措施4.2.1做好濾滅菌不徹底的激素類及抗生素類等物質(zhì)的防治可能是高壓滅菌不徹底造成的,或經(jīng)高壓滅菌后的培養(yǎng)基加入了未經(jīng)微孔濾膜過濾滅菌的或過濾滅菌不徹底的激素類或抗生素類等物質(zhì)。預(yù)防措施是:嚴(yán)格高壓蒸汽滅菌程序,保證滅菌時(shí)間:當(dāng)高壓滅菌鍋內(nèi)壓力達(dá)到49.0kPa時(shí),開啟放氣閥,將鍋內(nèi)的冷空氣全部排出;當(dāng)壓力生至108kPa、溫度為121℃時(shí),維持20-30min,即可達(dá)到滅菌的目的。4.2.2接種操作的預(yù)防一般在污染部位有不同顏色的霉菌,多為真菌污染。造成真菌污染的原因多為周圍環(huán)境的不清潔、超凈工作臺的過濾裝置失效、培養(yǎng)容器口徑過大、操作人員咳嗽或說話、接種操作不當(dāng)?shù)?。預(yù)防措施是:保持接種室潔凈,定期用甲醛和高錳酸鉀熏蒸消毒;在接種前用紫外燈滅菌20-30min;75%酒精噴霧殺菌降塵,超凈工作臺開啟l5-20min后方可使用;接種人員最好戴上帽子和口罩,接種時(shí)禁止說話,手和袖口不要在材料和瓶口上方移動(dòng)等。4.2.3外植體的消毒消毒一般菌類呈黏液狀物,而且在接種后1-2天即可發(fā)現(xiàn),多為細(xì)菌污染?？赡芤蛲庵搀w消毒不徹底、操作人員手未徹底消毒、鑷子消毒不徹底所致;。預(yù)防措施是:嚴(yán)格按消毒程序進(jìn)行,對于一些凹凸不平或有茸毛的外植體可加吐溫-80等濕潤劑的辦法,增加其滲透性,以提高殺菌效果。一般用0.1-0.2%升汞作滅菌劑最好,因其穿透力強(qiáng)。另外,也可將外植體在室內(nèi)或無菌條件下先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)以減少材料的污染;如需到田間采取外植體,最好在晴天的下午進(jìn)行,因材料經(jīng)日曬后可殺死部分菌類。操作人員的手應(yīng)經(jīng)常用75%酒精消毒,鑷子和接種針在使用前必須在火焰上灼燒,并每接種1-3瓶滅菌1次。4.3在培訓(xùn)過程中，很容易出現(xiàn)一些問題和預(yù)防措施4.3.1生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可能是因表面滅菌劑濃度過高、處理時(shí)間過長;植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)用量過多;培養(yǎng)溫度過高等因素造成的?？蛇x用降低滅菌劑處理濃度或減少處理時(shí)間,適當(dāng)降低激素濃度或降低培養(yǎng)溫度等方法,以預(yù)防此現(xiàn)象發(fā)生。4.3.2外植體的培養(yǎng)褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活,使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,培養(yǎng)物也隨之進(jìn)一步變褐而死亡。它是植物組織培養(yǎng)的三大難題之一。影響褐變發(fā)生的因素極其復(fù)雜,隨著植物種類、基因型、外植體的部位及生理狀態(tài)等的不同,褐變的程度也有差異。所以,選擇適宜的外植體并建立最佳的培養(yǎng)條件是防止外植體褐變最主要的手段。一般選擇幼嫩的器官和組織做外植體,切取外植體時(shí)盡量減少傷口面積及選擇適宜的消毒劑;適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度,降低PH值,降低細(xì)胞分裂素濃度等,可顯著減輕培養(yǎng)物褐變;適宜的溫度及在初始培養(yǎng)的1-6周內(nèi)用暗培養(yǎng)或在150lx左右的光強(qiáng)下進(jìn)行光培養(yǎng)可抑制酚類物質(zhì)氧化。另外,對培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移,在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或活性炭,都可有效抑制褐變。4.3.3培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素有的組培苗在多次繼代培養(yǎng)中,其葉和嫩梢呈水晶透明或半透明,植株矮小,失綠,葉片卷縮,發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。它和菌類污染、褐變統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題。若細(xì)胞分裂素濃度過高或細(xì)胞分裂素與生長素相對含量高,培養(yǎng)基中離子種類、比例不適,瓊脂濃度低,溫度過低或過高,光照時(shí)間過長及通氣不良,易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。預(yù)防措施是:適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素用量;提高Ca2+、Zn2+等離子濃度,降低N與Cl元素的比例,降低銨態(tài)氮濃度,適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度;增加自然光照等,可減少玻璃化苗的產(chǎn)生。4.3.4植物組織培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中,常發(fā)生組培苗難以生根的現(xiàn)象,可能由于生長的小苗本身能合成豐富的生長素的緣故。所以,將組培苗放在無激素的培養(yǎng)基上或使用1/2基本培養(yǎng)基培養(yǎng)可提高生根率;另外,在生根階段的培養(yǎng)基中,將蔗糖的濃度降到1.0-1.5%,可促進(jìn)植株增強(qiáng)自養(yǎng)能力,以誘導(dǎo)其生根?，F(xiàn)今,植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)滲透到植物生理學(xué)、遺傳學(xué)、生物制藥、植