花卉組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

植物組織培養(yǎng)是指將植物部分移植到合成培養(yǎng)基中，按照預(yù)定義的方向發(fā)展并種植新植物。植物組織培養(yǎng)按其原始的意義,是指愈傷組織培養(yǎng)。發(fā)展至今,其范圍日益擴(kuò)大,已包括植物和它的離體器官(胚、花藥、子房、根、莖和葉片)、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術(shù)。組織培養(yǎng)的組培苗是一項能獲得大量同源母本基因幼苗的生物技術(shù),又稱植物克隆育苗技術(shù),具有優(yōu)質(zhì)、均勻、分蘗性強(qiáng)、繁殖率高、批量生產(chǎn)、周年供應(yīng)、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點,尤其是有些受病毒侵染的花卉,其產(chǎn)量、質(zhì)量不斷下降,采用莖尖脫毒技術(shù),可以使病株復(fù)壯。因此近年來花卉組織培養(yǎng)及快繁脫毒技術(shù)越來越多地應(yīng)用于花卉種苗繁殖生產(chǎn)中,對組織培養(yǎng)中外植體材料的選取,組培中光照、溫度、空氣、相對濕度、支撐材料以及組培苗污染的來源、污染菌類的檢測及防治研究得較多,現(xiàn)綜述如下。1國內(nèi)外花卉群苗的栽培和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展動態(tài)1.1國外植物組培技術(shù)的發(fā)展1960年法國的莫瑞爾(Morel)建立的蘭花組培苗工廠,標(biāo)志著世界上第一家花卉組培苗實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。進(jìn)入20世紀(jì)80年代以后,花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)得到了較快發(fā)展,世界各國競相投資,角逐激烈,美國已建立起200多個生物工程公司,聘請大批專家教授從事植物組培研究;日本也是組培技術(shù)發(fā)展較快的國家之一,把組培技術(shù)納入國家三大全新產(chǎn)業(yè)之一;英國已有100多家生物工程研究機(jī)構(gòu),其中都有從事組培工作;世界最大的花卉王國荷蘭,其花卉種苗的組織培養(yǎng)已相當(dāng)普及,許多大公司都擁有自己的組培室,在無性繁殖的花卉種苗中,80%以上是通過組培繁殖;以色列花卉種苗的組織培養(yǎng)也發(fā)展迅速,如在盆花組培苗生產(chǎn)方面,以色列的本澤(Benzur)苗圃可提供盆栽觀賞植物100種以上的組培苗;泰國采用組培方法,很好地解決了熱帶蘭花用常規(guī)方法繁殖速度慢的矛盾,將大量熱帶蘭暢銷世界各國。目前,世界上可進(jìn)行規(guī)模化商業(yè)化生產(chǎn)的觀賞花卉種類約包括60余科,近1000種,組培苗生產(chǎn)量從1985年的1.3億株猛增到2002年已超過10億株。1.2花花茶花的生產(chǎn)中國從20世紀(jì)70年代初開始研究組培技術(shù),但發(fā)展速度較快,普及面較廣,現(xiàn)已處于國際領(lǐng)先水平,開發(fā)利用實現(xiàn)了規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化。全國農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園林等領(lǐng)域里,國家級、省級、市級、縣級的科研單位、大專院校、包括個體的花卉公司等幾乎都擁有植物組培室,尤其是部分省份或地區(qū),如廣東、海南、上海、云南、福建、浙江、廣西等地,花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)已具規(guī)模。如:云南省農(nóng)科院園藝所花卉研究中心花卉組培苗已工廠化生產(chǎn),目前建設(shè)的組培室周年不間斷滿負(fù)荷生產(chǎn)能力為5000萬株;廣州花卉研究中心工廠化生產(chǎn)觀葉植物組培苗年產(chǎn)量也達(dá)千萬株以上,中山大學(xué)、華南植物園、廣東省林科院年花卉組培苗均為幾十萬至幾百萬株;云南玉溪高新技術(shù)開發(fā)區(qū)實現(xiàn)了熱帶蘭花組培苗規(guī)?；a(chǎn);總體來說,中國花卉組培苗的科研和生產(chǎn)在技術(shù)水平和產(chǎn)業(yè)化規(guī)模上與國際水平相當(dāng),正在與國際商業(yè)性生產(chǎn)接軌,前景廣闊。2花卉組外植體材料的選擇2.1具有全能性的部位花卉組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞的全能性,即生物個體上任何一個具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞,在一定條件下都可以重新再分化形成原來的個體。從這點來講,越是具有全能性的部位其組培的成功性越高。植物具有全能性的細(xì)胞通常有三類:一是受精卵;二是發(fā)育中的分生組織細(xì)胞:即分生組織、根尖、嫩尖、幼葉、花等;三是雌、雄配子及單倍體細(xì)胞。因此,在花卉組織培養(yǎng)中,外植體的最佳選擇就形成了一定的范圍,即裸子植物:幼苗、芽和韌皮部細(xì)胞;被子植物:胚、莖尖(莖段)、根、葉等組織和器官;孢子植物(藻類、蕨類、苔類等):目前取材多為葉。2.2提交時間大多數(shù)植物應(yīng)在生長開始的季節(jié)進(jìn)行采樣,生長末期或休眠期的外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍。2.3編輯狀態(tài)沿花卉的主軸,越往上的部位經(jīng)組培形成的器官其生長的時間越短,且越容易形成花器官;而下部組織產(chǎn)生營養(yǎng)芽的比例較高。2.4葉原基莖尖的培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)時,切取莖尖的大小對培養(yǎng)的成活率影響很大。一般來說,切取0.5～0.8mm帶2個葉原基莖尖進(jìn)行培養(yǎng)就可以。莖尖越大,成活率越高,以后生長也越旺盛,且操作容易掌握。但莖尖越大,越不易達(dá)到脫毒的目的。3花卉組繁殖條件的研究3.1光飽和和點對組培苗光合的影響光環(huán)境是影響組培苗光合作用和生長的內(nèi)在因素。光環(huán)境包括光量、光質(zhì)和光周期3個因子。植物的光合作用隨光量的增加而提高,當(dāng)光量增加到一定限度后,光合強(qiáng)度反而下降,這個臨界的光量值就是光合作用的光飽和點。大多數(shù)物種組培苗的光飽和點較低,一般在100～150μmol/(m2·s),當(dāng)超過光飽和點后,光合作用的效率就會下降,并造成光器官的不可逆損傷;光質(zhì)對光合作用的影響是指不同波長的光對光合作用的影響;光周期對組培苗生長的影響是指在光合光量子通過量較大的情況下,光期與暗期對組培苗的影響。關(guān)于光質(zhì)和光周期對光合作用影響的研究目前尚不充分。3.2不同高差的組培苗的變溫管理組培室溫度在空間和時間上的分布不均勻。Kozai等研究了日平均溫度20℃下的3個不同溫差,即+10℃(光期25℃、暗期15℃)、0℃(光期20℃、暗期20℃)、-10℃(光期15℃、暗期25℃)變溫管理對組培苗的作用效果。結(jié)果表明,苗體高度隨溫差的增大而增大,但組培苗的干重和鮮重不受溫差值的影響。3.3生根率、葉面積、壯健程度采用透氣性封口膜進(jìn)行培養(yǎng)時,植株的干重、生根率、葉面積、健壯程度均好于無透氣性封口膜。在培養(yǎng)瓶中增加C02濃度時,植株的生根率、健壯程度高于不增加CO2濃度的對照。3.4相對濕度培養(yǎng)瓶中相對濕度不能過高,否則會導(dǎo)致組培苗葉片生長不正常和蒸騰作用受抑制。3.5支持材料目前,組培常用的支撐材料是瓊脂。但以聚乙烯發(fā)泡材料、巖棉、蛭石、陶瓷纖維和植物纖維的扁平壓制塊作支撐材料,更有利于組培苗的生長。4花卉植物組織培養(yǎng)污染防治4.1牧草及寄主植物污染植物組培污染主要是霉菌、細(xì)菌和酵母菌引起的污染。霉菌和酵母菌在培養(yǎng)條件下生長快,很容易觀察到,而細(xì)菌潛伏期較長,很難在前期觀察到癥狀。LeifertC等認(rèn)為細(xì)菌污染的主要來源有3個:材料內(nèi)部滅菌處理不好,這樣造成的污染占污染總數(shù)的1/3～1/2;在正常的滅菌條件下,內(nèi)生菌能夠成活,這樣的污染占污染總數(shù)的1/4;來自寄主植物的污染,占污染總數(shù)的1/4～1/2。JennetBlake等認(rèn)為:牧草蟲和螨的體表帶有霉菌的孢子和細(xì)菌,在9,10月份是重要的污染源。GReustle等(1988)也認(rèn)為8月和9月牧草蟲的大量繁殖階段,造成了組培污染的嚴(yán)重發(fā)生。FEnjalric等(1988)在對三葉膠初級培養(yǎng)污染的研究中發(fā)現(xiàn)高溫、多雨的環(huán)境更有利于污染的發(fā)生,而且隨著植物材料年齡的增長,植物材料的健康狀況不斷惡化,組培污染也會更加嚴(yán)重。經(jīng)FEnjalric等研究認(rèn)為外植體帶菌多少的順序為:腋芽<莖尖<頂點。大多數(shù)研究者認(rèn)為外植體的狀況、環(huán)境條件和操作過程是引起污染的主要原因。4.2細(xì)菌污染檢測霉菌和酵母菌造成的污染一般很容易觀察到,而細(xì)菌污染有很長的潛伏期,它甚至在幾次繼代后才能表現(xiàn)出來,因此Leifert等(1989)認(rèn)為植物組培快繁的各種污染物的危害中,細(xì)菌是最嚴(yán)重的。鑒于細(xì)菌污染的特點,要消除細(xì)菌污染,必須對細(xì)菌進(jìn)行探測。探測細(xì)菌污染存在的方法很多。Ph.Boxus等(1988)探測潛在細(xì)菌時,在培養(yǎng)基中加入蛋白胨(265mg/L)和酵母菌抽提物(88mg/L)。在這樣的條件下,調(diào)查瓊脂表面濃縮水的渾濁度或透明度就能探測到細(xì)菌污染程度。4.3抗生素的種類細(xì)菌污染的消除有些研究人員希望用抗生素防治,抗生素可以直接加入到培養(yǎng)基中,也可以用抗生素浸泡外植體和噴灑外植體的親本。但是植物種類不同,所用抗生素的種類、濃度和處理時間也不同,還有抗生素對污染消除根本不起作用,甚至是植物毒素。JFisse等(1987)用頭孢菌素Ⅱ和鏈霉素消除觀賞植物外植體中內(nèi)生菌非常有效。實驗證明,抗生素在植物組培污染的防治方面起了重要的作用,但是針對不同的植物品種要想找到一種合適的抗生素處理組合是比較困難的,工作也比較繁瑣。4.4,用于微生物病目前,酵母菌污染的研究相對較少。GBPoulsen等(1988)在蘋果砧木M26分裂組織微生物消除的研究中,測試了幾種物質(zhì)對酵母菌的毒性,雖然它們對植物材料都沒有傷害,但是沒有一種能夠消除酵母菌。總之,目前花卉組培苗已大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn),并且主要用于病毒病的消除[26,27,28,29,30,31];良種的快速繁殖;單倍體育種(花粉、花藥、胚珠等培養(yǎng));