石斛組織培養(yǎng)研究進展

石斛是蘭花科的第二個屬，是多年生草本植物，世界上有1500種。多生于樹皮或巖石上,開花多,結果少,每果可含100萬粒種子。種子細如粉塵,每粒重約0.3~0.4μg。種胚不超過球形階段,即存在后熟現(xiàn)象。由于缺乏胚乳組織,需與真菌共生(symbiotical)才能萌發(fā),自然條件下發(fā)芽率一般不及5%。石斛為合軸生長(sympodial),分株是其繁殖的主要方式,對生長條件的要求較為苛刻。石斛屬植物中有不少是名貴中藥,在《本草綱目》中石斛被列為上品。我國76種石斛屬植物中有近40種作藥用,著名的有D.nobile(金釵石斛)、D.candium(鐵皮石斛)、D.huosanness(霍山石斛)等。具有強陰益精、補腎益力、輕生延年等作用,其應用范圍正迅速擴大。石斛屬植物約有四分之一可供觀賞,稱為石斛蘭D.orchids,以花艷麗而著稱,近年作為觀賞植物發(fā)展迅速,已形成獨立產業(yè)。集藥用和觀賞于一體的價值,加之過度的采伐利用和繁殖率低,造成了石斛供需之間的緊張狀況,我國已將其列為瀕于絕滅的受保護的中藥品種之一。自1960年法國人Gmorel利用石斛基尖組織培養(yǎng)無病毒植株的無性繁殖技術創(chuàng)立以來,石斛組織培養(yǎng)逐步走向深入化。近年來,石斛組織培養(yǎng)的最佳條件,包括光照、溫度、pH以及如何選用外植體,選用激素等取得長足進展,并利用組培技術研究種子萌發(fā)過程中的生理生化變化等,還獲得了轉基因石斛植株。我國石斛組織培養(yǎng)研究起步較晚,直到1984年,徐云鵬等才首次報道獲得霍山石斛試管苗。此后又利用鐵皮石斛、束花石斛、兜唇石斛的莖尖、葉尖或種胚獲得了再生植株。1分離型原球莖plbs組織培養(yǎng)獲得石斛再生植物株的途徑有器官發(fā)生型和原球莖發(fā)生型兩種。器官發(fā)生型通過外植體組織培養(yǎng),使預先存在的分生組織形成芽(如腋芽)或不定分生組織(如子葉、莖段、愈傷組織等)形成不定芽。此途徑又可分為3種類型:無菌短枝型(又稱節(jié)培法),芽增殖型,器官發(fā)生型;原球莖發(fā)生途徑通過石斛適宜外植體誘導產生胚性愈傷組織并增殖,隨后形成類胚組織原球莖進而發(fā)育成完整的再生植株。通常由種子離體培養(yǎng)產生的胚性組織稱原球莖(protocorm),而上外植體葉尖、基尖等誘導形成的胚性組織稱為擬原球莖(protocormlikebodies)即PLBs。原球莖或擬原球莖轉入不含任何激素或生長素的培養(yǎng)基(如MS)便可再生出完整小植株。1.1原文影響原球莖發(fā)生的主要有外植體的大小、來源、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基類型、激素濃度,種類、處理時間及一些其它因素。1.1.1bs的發(fā)生石斛組培擬原球莖的誘導可以選擇花序枝、葉尖、莖節(jié)切段等作外植體。LamChanLT等用D.somia的花序枝尖作外植體在VW培養(yǎng)基上誘導PLBs的發(fā)生,結果以1~3mm的外植體形成的PLBs數目最多。取莖基部的分蘗芽或莖的頂芽作外植體,前者好于后者。Kim報道取側芽進行液體培養(yǎng),在45d內開始形成擬原球莖。以種子離體培養(yǎng)形成原球莖的能力與其種齡有關,葉秀鱗取鐵皮石斛2~6個月種齡的胚進行離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),種齡愈長;其胚細胞愈多,萌發(fā)形成原球莖的頻率就越高,但4,5,6個月種齡的胚差不多。曾宋君用5種石斛的種子在N6培養(yǎng)基上進行組培得出了相似的結論。1.1.2d.fim力量的來源選擇適宜的培養(yǎng)基對石斛的分化至關重要,常用的培養(yǎng)基為MS,Nitch,KnudsoC(KC),N6等。DeviJ等利用D.moschatum的莖尖在5種培養(yǎng)基上誘導PLBs的發(fā)生,結果以Nitch培養(yǎng)基的效果最好;SumanK1991年在KL,VW,MS,W,Nitch,Mitra6種培養(yǎng)基上進行D.fimbria-tum種子的離體培養(yǎng),結果發(fā)現(xiàn)在Nitch,VW上培養(yǎng)基上萌發(fā)率高達91%,其次是MS(85%),在MS,Nitch,VW上培養(yǎng)4~5d便出現(xiàn)原球莖,其它培養(yǎng)基則出現(xiàn)較遲。MS培養(yǎng)基上獲得的原球莖體積最大,因此作者推斷D.fimbriatum的種子萌發(fā)及發(fā)育需要鹽分較高的培養(yǎng)基。這與周華偉報道的石斛組培的結果相似。曾宋君以D.candium,D.loddigesi,D.wagii,D.densiflorum,D.fimbriatum5種石斛在MS,KS,SH,VW,KC,改良N6及PT培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng),得出石斛的最適通用培養(yǎng)基是改良N6或PT培養(yǎng)基附加0.2mg·L-1的NAA和2%蔗糖。此外,側芽和頂芽對培養(yǎng)基的要求也各不相同,VW液體培養(yǎng)基對節(jié)生花型石斛效果較好,在4~5周內即可形成PLBs;蝶生花型和常綠類石斛的腋芽用KC固體培養(yǎng)基要比KC液體培養(yǎng)基好,以頂芽作外植體則正相反。繼代和初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以不同。石斛的原球莖易分化成苗,故繼代培養(yǎng)基以液體振蕩培養(yǎng)可獲得較佳效果。1.1.3分離的plbs一般高濃度的細胞分裂素有利于誘導芽的發(fā)生,而高濃度的2.4-D對愈傷組織的誘導形成有促進作用。愈傷組織的不規(guī)則分裂會導致擬原球基和不定芽的發(fā)生,LanC以花枝尖作外植體在VW培養(yǎng)基上添加1mg·L-16-BA和0.1mg·L-1NAA或添加1mg·L-1Kintin和0.1mg·L-12.4-D均能獲得高比例的PLBs,周月坤在MS培養(yǎng)基上附加0.5mg·L-16-BA和0.5~2.0mg·L-12.4-D,由葉基部誘導產生愈傷組織,進而分化出擬原球莖獲得完整植株,并指出2.4-D對誘導愈傷組織形成和分化有重要作用,NAA的加入對分化PLBs的有一定的促進作用。王光遠以D.candium種子離體培養(yǎng),在MS上添加0.5mg·L-1NAA,暗處培養(yǎng)1周后產生大量的愈傷組織,轉入光照培養(yǎng),原球莖大量發(fā)生。外加激素ABA對原球莖的分化也會產生影響,在添加0.5mg·L-1ABA的MS培養(yǎng)基上預培養(yǎng)15d后轉入含2mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),150d后其試管開花率達84.0%,而不用ABA預處理的,其成花率只有27.0%。如果原球莖繼續(xù)在含ABA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)則不會有培養(yǎng)體花芽的發(fā)生。1.1.4石斛對培養(yǎng)體的影響除了外植體、培養(yǎng)基、激素影響外,光照、溫度、pH以及外源添加物等也會影響原球莖或PLBs的發(fā)生及發(fā)育。石斛組培常用的溫度為(26±1)℃,光強1600~2000lx,日照光8h,pH為5.0~5.5。當然,在組織培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)體的代謝活躍改變培養(yǎng)基的pH,進而會影響到培養(yǎng)體的生長,SharonM等在培養(yǎng)D.snowfire原球莖的過程中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基的pH值在45d后由5.1降至4.1,培養(yǎng)體變成褐色,但通過反復轉入新鮮培養(yǎng)基可防止或消除褐變現(xiàn)象。石斛組培過程中最常用的添加物是10%~25%的椰乳(CW)。另據曾宋君的研究,CW可用廉價的香蕉汁,馬鈴薯汁、蕃茄汁取代。蔗糖對胚萌發(fā)及成苗的效果不及白糖或片糖,在組培過程中加入活性炭是必要的,它可以除去瓊脂中的毒性物質或培養(yǎng)物產生的芳香族代謝廢物、防止組織褐變,并刺激胚胎的發(fā)生與生根。因石斛的胚性外植體即便在有生長素存在時也較難生根,因此如何使芽生根則是成苗的關鍵。1.2器官疾病影響3種類型器官發(fā)生的因素包括外植體、培養(yǎng)基、激素等。1.2.1石斛再生苗的制備又稱節(jié)培法或微型扦插法,即將待繁殖的材料如石斛莖節(jié)、花梗、枝等剪成帶一葉的單芽莖段,轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。MosichSE等即是通過莖段培養(yǎng)獲得完整小植株的,其方法是將石斛的莖段(長度>10cm)按2∶3∶2切成3段,上段滅菌5~7min,中段10~15min,下段20~15min,滅菌后切去兩端變色的組織,再橫切成段,下端插入改良Knop培養(yǎng)基,4周后芽開始生長,隨后轉入MS培養(yǎng)基即獲得石斛再生苗。1.2.2不同石斛中3種生長量的培養(yǎng),vw和kt對7.即通過莖尖或初代培養(yǎng)的芽在適宜的培養(yǎng)基上誘導,不斷發(fā)生腋芽進而形成叢芽,隨后轉入生根培養(yǎng)基行生根培養(yǎng)從而獲得再生植株。Sobhana等利用5種石斛D.moschatum,D.fimbriatum,D.nobile,D.crumenatum和D.pierardii腋芽分別以VW,KC,MS,Morel培養(yǎng)基進行離體培養(yǎng),各培養(yǎng)基均附加3mg·L-16-BA和1mg·L-1NAA,誘導芽的增殖,結果以VW產生的芽培養(yǎng)體數目最多。此外,作者以VW培養(yǎng)基附加BA或KT(濃度分別為1,2,3,4,5,6mg·L-1)添加或者不添加NAA(1mg·L-1)進行試驗,證實6-BA可以產生最大數量的叢生芽,5種石斛中又以D.moschatum數目最多,D.pierardii添不添加NAA結果相似。這說明培養(yǎng)基的種類、激素的濃度及種類對不同石斛芽的增殖有很大影響,如果以莖段作外植體,其取向至關重要。在NayakNr等的研究中,D.phylum和D.moschatum莖節(jié)切段作水平放置可以獲得再生植株,而垂直放置的處理則無任何莖芽的發(fā)生。值得注意的是NiharRanjan首次將一種高細胞分裂素活性的物質thidiazuron(TDZ)應用于石斛的組織培養(yǎng)并與6-BA比較作用效果,結果后者比前者更有效。其最佳作用濃度為2.2~4.5μmol·L-1,提高TDZ的使用濃度會對莖芽的再生產生抑制作用。TDZ是1種雜環(huán)芳香脲,在大豆、小紅蘿卜的子葉、煙草、金甲豆等組培中廣范用于誘導芽的增殖,效果顯著。在組織培養(yǎng)中若加入10.8μmol·L-1的6-BA,誘導生根會比NAA更有效。其特點是繁殖速度快,是莖尖培養(yǎng)和脫毒菌初期必由之路,而石斛組培中的關鍵又在于促進生根。1.2.3外植體的發(fā)育方向由愈傷組織直接形成不定芽,然后轉入生根培養(yǎng)基中可誘導生根而形成完整的小植株。以石斛的基節(jié),幼嫩小葉、花梗等作外植體均可獲得較好的誘導效果。此外也有由“原球莖”形成愈傷組織的報道。葉秀鱗觀察到由D.candium種子離體培養(yǎng)形成的原球莖,轉入N6培養(yǎng)基培養(yǎng)時,表面細胞發(fā)生不規(guī)則分裂,產生大量愈傷組織,隨后由愈傷組織分化形成不定芽再發(fā)育成幼苗。外植體的發(fā)育階段不同也會影響其發(fā)育方向的不同,以基尖為例,帶有葉原基的莖尖頂端形成芽、基部則形成愈傷組織,而不帶葉原基的莖尖只在基部形成愈傷組織,隨后分化出不定芽和擬原球莖。MadhuriSharon等將原球莖一特定部位處作劃傷處理,未劃傷的作對照,結果發(fā)現(xiàn)劃傷的原球基形成大量愈傷組織而對照直接形成完整小植株。2問題和視角2.1果率:2.2%100%,操作上費工又付費在自然條件下僅鐵皮石斛能傳粉結果,結果率也僅有17.3%。雖然人工授粉可以大大提高大多數石斛種的結果率(72.1%~100%),但操作上費工又費時。制作人工種子則是一條可行的途徑,可以原球莖或擬原球莖等為材料外加包被物制得。郭順星等已成功的以原球基為材料,3%海藻酸鈉和2%CaCl2為人工種皮制成鐵皮石斛人工種子,其在1/2MS+蔗糖的培養(yǎng)基上生長良好。但直接用于栽培的人工種子卻尚無研究。2.2植物葉片相關原則組織培養(yǎng)過程中次生代謝產物的研究對石斛尤為重要,而這一研究在國內甚為鮮見或甚至是空白。國外也較少,僅NanGL等1997年報道在石斛PLBs的組織培養(yǎng)過程中有大量的松柏醇產生。同屬于藥用植物的人參、地黃等組織培養(yǎng)過程中次生代謝產物人參皂苷,毛地黃苷等已進入工業(yè)化生產試驗階段。鄭光植等從三分三的根、莖、葉,種皮甚至是花藥的愈傷組織培養(yǎng)產生莨菪堿及東莨菪堿,且5種愈傷組織中以莖愈傷組織的兩種生物堿產量最高,含量均超過了原植物根的提取物。石斛植物中含有多種生物堿、抗癌菲、類黃酮等物質,這些物質是否在組織培養(yǎng)中產生,產量在哪一階段的培養(yǎng)中最高等,這些問題都有待于研究,以便從根本上解決石斛生長緩慢,栽培條件要求較嚴的問題,并有利于通過生物技術獲取這些藥用成分。2.3農桿菌誘導法轉化石斛利用根癌農桿菌介導法獲得轉基因植物的關鍵是毒性基因的誘導表達,而在單子葉植物中常常缺少這種誘導物質。近來的研究者NanGL等在石斛組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)PLBs發(fā)育早期有大量的松柏醇產生,它可誘導毒性基因的表達。如果將在暗處培養(yǎng)的PLBs轉入光照條件下培養(yǎng),其含量呈6倍量增加。PLBs松柏醇的產量是葉的11倍,這使通過農桿菌介導法可獲得轉基因植物,即將克隆的花色基因、主成分表達基因等通過農桿菌介導法轉入石斛PLBs成為可能。此外基因槍法獲得石斛轉基因植物業(yè)已實現(xiàn),ChiaTF等已成功的將熒光素酶基因(luc)通過W粒子微彈射擊導入PLBs,并在由PLBs培養(yǎng)成的小植株中表達。石斛蘭作為四