木聚糖酶產(chǎn)生菌SN01的發(fā)酵條件優(yōu)化生物工程類1003班，第2組，鄭宇璁（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京210009）關(guān)鍵詞：木聚糖酶；發(fā)酵條件；DNS法；酶活力；最佳條件摘要：目的：通過對不同培養(yǎng)條件下木聚糖酶產(chǎn)生菌SNO1發(fā)酵液催化木聚糖水解產(chǎn)物的測定探究其最佳發(fā)酵條件，以便對今后該菌的發(fā)酵條件優(yōu)化提供指導(dǎo)。方法：通過DNS法測定發(fā)酵液對同濃度木聚糖催化反應(yīng)相同時間產(chǎn)生的分解產(chǎn)物，即還原糖的測定，測定，間接體現(xiàn)其酶活力，進而反應(yīng)SNO1菌在對應(yīng)生長條件下的生長情況。結(jié)論：木聚糖酶產(chǎn)生菌SN01最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為棉酚蛋白，最佳金屬離子為4H2O.MnCl2，最低為不加入金屬離子。前言：在微生物生命活動中，必須從環(huán)境中吸取一些物質(zhì)，以提供能量，調(diào)節(jié)新陳代謝并合成細(xì)胞物質(zhì)，這些物質(zhì)統(tǒng)稱營養(yǎng)物質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)是微生物生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。半纖維素的主要成分是木聚糖，木聚糖（Xylan）是一種多聚五碳糖,是植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素外最為豐富的多糖，也是自然界中最為豐富的可再生資源之一，占植物細(xì)胞干重的15%～35%。木聚糖主要存在于植物細(xì)胞的次生壁中，處于木質(zhì)素及其他多聚糖之間,起著連接作用，有些植物的初生壁中也有發(fā)現(xiàn)。木聚糖的主鏈由β-D-吡喃木糖殘基經(jīng)β-1，4-糖苷鍵連接成，依來源不同，可以有不同的側(cè)鏈取代基，自然界存在的木聚糖形式多樣，結(jié)構(gòu)變化非常大，且多為異型多糖。木聚糖酶（[EC]）屬水解酶類，是指將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶。由于不同來源的木聚糖主鏈的聚合度、支鏈殘基的種類、數(shù)量、長度及其在主鏈上結(jié)合位點的不同，要徹底降解木聚糖需要多種酶共同參與協(xié)同。目前已知產(chǎn)木聚糖酶的微生物有幾十個屬、一百多個種。在海洋及陸地細(xì)菌、海洋藻類、真菌和反芻動物瘤胃、蝸牛、甲殼動物、陸地植物組織和各種無脊椎動物中都存在。已報道的能產(chǎn)木聚糖酶的微生物有細(xì)菌、鏈霉菌、曲霉、青霉、木霉等，研究和應(yīng)用最多的是細(xì)菌、曲霉和木霉產(chǎn)的木聚糖酶。多數(shù)細(xì)菌和真菌分泌胞外木聚糖酶,將木聚糖水解成單糖，再進入微生物細(xì)胞供代謝利用。也有一些微生物，如瘤胃細(xì)菌、黏液球菌及黑曲霉中的一些種類，也產(chǎn)生胞內(nèi)酶。木聚糖酶已經(jīng)在食品、飼料、造紙等眾多工業(yè)領(lǐng)域充分顯示出了它巨大的應(yīng)用潛力，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究手段的不斷豐富，必然會誕生一大批適合不同應(yīng)用領(lǐng)域要求的木聚糖酶優(yōu)良新品種，為解決人類發(fā)展中可能遇到的能源、糧食、環(huán)境等諸多問題做出巨大的貢獻，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。此外，加強木聚糖酶的研究和開發(fā)，將有力地推動我國生物技術(shù)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義。自20世紀(jì)60、70年代開始研究木聚糖酶以來，人們越來越發(fā)現(xiàn)木聚糖酶具有重要的應(yīng)用價值，因此人們對其加大了開發(fā)研究。目前，國際上對木聚糖酶的研究工作主要集中在對微生物木聚糖酶的誘導(dǎo)、提純、鑒定及基因的克隆與表達等方面。與國外相比，我國對木聚糖酶的研究起步較晚，主要集中在產(chǎn)木聚糖菌種的篩選和馴化，木聚糖的純化好理化性質(zhì)的研究等方面，只克隆了少數(shù)木聚糖酶基因。正是由于木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)決定了其在應(yīng)用上的潛力即應(yīng)用領(lǐng)域，目前對于木聚糖酶的研究熱點主要有如下幾個方面：eq\o\ac(○,1)從天然微生物中篩選性能更為優(yōu)良的木聚糖酶。eq\o\ac(○,2)加深對木聚糖酶分子作用機理的了解。eq\o\ac(○,3)優(yōu)化發(fā)酵條件，進一步提高木聚糖酶的合成水平。eq\o\ac(○,4)采用基因工程手段改良菌種，已獲得更多高產(chǎn)菌株。⑤通過基因工程和蛋白質(zhì)工程改良木聚糖酶的性質(zhì)，研制出符合不同應(yīng)用領(lǐng)域要求的木聚糖酶產(chǎn)品。本研究通過培養(yǎng)就優(yōu)化的初步研究，以期得到產(chǎn)酶量高的菌株。提高微生物產(chǎn)酶能力是保證酶產(chǎn)品生產(chǎn)的關(guān)鍵1材料與方法1.1實驗材料1.12菌種：木聚糖酶產(chǎn)生菌SN011.13生化試劑：碳源：蔗糖、麥芽糖、羧甲基纖維素、微晶纖維素、糊精、甘油（30%水溶液）氮源：硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、棉酚蛋白、玉米漿干粉無機鹽：無水MgSO4、5H2O·CuSO4、7H2O·ZnSO4、6H2O·NiCl2、4H2O·MnCl2實驗耗材：250ml三角瓶：50個；試管：50支；500ml燒杯3個；玻璃棒3支；50ml量筒3個；1ml移液管3支，50μl移液槍3支1.14設(shè)備：搖床；分光光度計。1.2實驗方法1.21菌種：種子液：對數(shù)期的種子液1.22發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響A碳源對產(chǎn)酶的影響基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，按照50ml/250ml分裝在六個三角瓶中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，分別改變碳源種類，其中除甘油外所有碳源的添加量均為5g/L，甘油取0.5mL/瓶。B氮源對產(chǎn)酶的影響基礎(chǔ)培養(yǎng)基：甘油10ml/l，氯化鈉5g/L，按照50ml/250ml分裝在六個三角瓶中。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別改變氮源種類，氮源的添加量均為20g/L。C金屬離子對產(chǎn)酶的影響基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，按照50ml/250ml分裝在六個三角瓶中。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各種金屬離子，添加量為0.2%（m/V），且需要扣除結(jié)晶水?！咀ⅰ苛硗鉁?zhǔn)備50ml乳糖溶液，濃度為20%，作為誘導(dǎo)劑。將以上所有配好的培養(yǎng)基及乳糖溶液用八層紗布及牛皮紙包扎好后滅菌，條件為121，20分鐘。滅菌后取出冷卻到室溫，將種子液按接種量1ml/瓶接入各個發(fā)酵液中，全部接好后，紗布包扎后放入搖床振搖，180r/min，37℃，振搖4個小時后取出，在超凈工作臺內(nèi)于無菌條件下往每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2ml滅過菌的乳糖溶液，重新包扎好后繼續(xù)放入搖床中振搖16~20小1.23木聚糖酶活力的測定：（1）DNS法測定還原糖的原理：還原糖是指含自由基或酮基的單糖和某些具有還原性的雙糖。它們在堿性條件下，可變成非?；顫姷南┒?。遇到氧化劑時，具有還原能力，烯二醇本身則被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。黃色的3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自己被還原為棕紅色的3-氨基-5硝基-水楊酸。在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液里棕色的深淺與還原糖的含量成正比，在波長為540nm處測量吸光度，查出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算，可以求得樣品中還原糖的含量。（2）木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液為母液分別用蒸餾水稀釋成0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40mg/ml木糖溶液，各取1.0ml至試管，再加入2mlDNS放入沸水中煮沸反應(yīng)10min，取出迅速放入有自來水的燒杯中冷卻至室溫,加入7ml蒸餾水，搖勻。用分光光度計在540nm波長下測定各試管中液體吸光值，空白對照試管用來調(diào)零。（3）木聚糖活力的測定測定步驟：1.總糖的測定：將發(fā)酵液稀釋5倍，精確吸取100ul稀釋后的發(fā)酵液于試管中，加入0.9ml木聚糖底物。2.空白的測定：精確量取1ml蒸餾水，混勻，在70度水浴條件下反應(yīng)10min，迅速放入盛有自來水的燒杯中冷卻至室溫，加入2mlDNS溶液，混勻，置于沸水中煮沸10min。迅速放入盛有自來水的燒杯中冷卻至室溫，加入水7ml使得反應(yīng)體積為10ml，充分搖勻后在540nm下測量吸光值。以空白對照調(diào)零。（4）計算酶活力：酶活力（U/g）=W(mg)*1000*N/(20(min)*0.1(ml))式中：W:酶解反應(yīng)產(chǎn)生的木糖量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=A+B*X得到，1000：將mg轉(zhuǎn)化成μg所乘的系數(shù)N：稀釋倍數(shù)，此處是N=520min:反應(yīng)時間0.1ml:發(fā)酵液體積2結(jié)果與分析2.1不同培養(yǎng)條件對于產(chǎn)木聚糖酶SNO1菌的影響2.11碳源的影響表1不同碳源培養(yǎng)條件下發(fā)酵液催化反應(yīng)產(chǎn)物測定碳源蔗糖麥芽糖羧甲基纖維素微晶纖維素糊精甘油OD5400.1360.2160.1080.1150.1140.1162.12氮源的影響表2不同氮源培養(yǎng)條件下發(fā)酵液催化反應(yīng)產(chǎn)物測定氮源硫酸銨氯化銨蛋白胨酵母粉棉酚蛋白玉米漿干粉OD5400.1520.1560.1510.1590.2560.1602.13金屬離子的影響表3不同金屬離子培養(yǎng)條件下發(fā)酵液催化反應(yīng)產(chǎn)物測定金屬離子無水MgSO45H2O·CuSO47H2O·ZnSO46H2O·NiCl24H2O·MnCl2無OD5400.1390.1320.1540.1420.2240.1282.2木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表4不同濃度木糖吸光值OD5400.1010.2180.3180.4140.5930.6960.823木糖濃度（mg/ml）50.4圖1木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2.3酶活力的計算1）不同碳源培養(yǎng)條件下產(chǎn)木聚糖酶菌SNO1酶活力表4碳源OD540木糖量W（mg）酶活力(U/g）蔗糖0.1360.1205301.25麥芽糖0.2160.1533383.25羧甲基纖維素0.1080.1091272.75微晶纖維素0.1150.1119279.75糊精0.1140.1115278.75甘油0.1160.1123280.75圖2不同碳源培養(yǎng)條件下產(chǎn)木聚糖菌SN01酶活力2）不同氮源培養(yǎng)條件下產(chǎn)木聚糖酶菌SN01酶活力表5氮源OD540木糖量W（mg）酶活力（U/g）硫酸銨0.1520.1271317.75氯化銨0.1560.1287321.75蛋白胨0.1510.1267316.75酵母粉0.1590.1300325.00棉酚蛋白0.2560.1697424.25玉米漿干粉0.1600.1304326.00圖3不同氮源培養(yǎng)條件下產(chǎn)木聚糖菌SN01酶活力3）不同金屬離子培養(yǎng)條件下產(chǎn)木聚糖酶菌SNO1酶活力表6金屬離子OD540木糖量W（mg）酶活力(U/g）無水MgSO40.1390.1218304.505H2O·CuSO40.1320.1189297.257H2O·ZnSO40.1540.1279319.756H2O·NiCl20.1420.1230307.504H2O·MnCl20.2240.1566391.50無0.1280.1173293.25圖4不同金屬離子培養(yǎng)條件下產(chǎn)木聚糖菌SN01酶活力2.4結(jié)論通過控制變量單因素實驗，木聚糖酶產(chǎn)生菌SN01最佳碳源為麥芽糖，其酶活性可達5140.0g，其次為蔗糖、甘油、微晶纖維素、糊精、羧甲基纖維素。最佳氮源為棉酚蛋白，其酶活性可達5965.0g，其次為玉米漿干粉、酵母粉、氯化銨、硫酸銨、蛋白胨。最佳金屬離子為4H2O·MnCl2，其活性可達5305.0g，其次為7H2O·ZnSO4、6H2O·NiCl2、無水MgSO4、5H2O·CuSO4，最低為不加入金屬離子。參考文獻[1]王俊峰，周啟扉，劉大偉，劉