鐵皮石斛的組培快繁研究

0鐵石斛在山區(qū)的繁殖與復(fù)育科貝夫是多年生草本植物。鐵皮石斛是傳統(tǒng)名貴中藥材,主要分布在秦嶺、淮河以南的皖、浙、云、貴、川等地的山區(qū),生于海拔1600m的山地半陰濕的巖石上。鐵皮石斛蒴果成熟時易開裂,且種子粒徑小,自然繁殖率低。由于鐵皮石斛的生長條件的特殊性和分布的局限性以及多年的人為過度采挖破壞,自然資源瀕臨枯竭。因此,為了保護和有效利用鐵皮石斛,采用組織培養(yǎng)技術(shù),大量快速繁殖鐵皮石斛組培苗顯得尤為重要。以鐵皮石斛離體器官誘導(dǎo)原球莖,再通過原球莖的增殖、分化培養(yǎng)而得到大量幼苗,這種快繁方法可加快鐵皮石斛繁殖速度,推進工廠化育苗。筆者以鐵皮石斛嫩莖為外植體進行鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)與增殖的研究。1材料和方法1.1試驗材料供試鐵皮石斛的嫩莖采于海南省萬寧市興隆熱帶植物園。1.2成球莖的誘導(dǎo)以幼嫩莖段為外植體,經(jīng)過外植體消毒處理,接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,經(jīng)過一段時間的誘導(dǎo),外植體膨大并產(chǎn)生原球莖,將誘導(dǎo)形成的原球莖轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基:MS+7.5g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH5.8。培養(yǎng)條件:溫度(25±1)℃,光強為2000lx,光照時間12h/天。數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。1.2.1植物消毒1.2.2莖誘導(dǎo)1.2.3原莖繁殖2結(jié)果與分析2.1不同消毒方法對莖段成活率活率的影響外植體的消毒是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵,對于原球莖誘導(dǎo)能否成功有非常重要的作用。采用3種不同消毒劑對外植體進行不同時間的消毒處理。由表1可知,鐵皮石斛莖段對消毒劑很敏感,不同的消毒方法莖段成活率活率差異較大;0.1%HgCl2+2%NaClO與0.1%HgCl2+10%H2O2的處理效果不好,外植體平均污染率高(分別為56.25%,40.25%)、平均成活率低(分別為3.25%,3.5%),0.1%HgCl2處理的效果較好,其平均污染率低(37%),平均成活率高(7.75%),0.1%HgCl2消毒8min的成活率最高(19%)。分析認(rèn)為,0.1%HgCl2處理時間為8min對鐵皮石斛嫩莖消毒的效果最好,污染率低(10%)、成活率高(19%)。2.2不同濃度6-ba和naa對原球莖激素表達的影響由試驗結(jié)果(表2)可知:不同處理對原球莖的誘導(dǎo)影響有顯著差異,6-BA+NAA激素組合的平均原球莖誘導(dǎo)率高于其它激素組合(48.05%),同時,6-BA+2,4-D組合的原球莖誘導(dǎo)時間都比較短(19天)。綜合考慮,選擇6-BA,NAA與2,4-D作為原球莖誘導(dǎo)的激素。確定誘導(dǎo)原球莖激素濃度的正交試驗結(jié)果見表3,不同濃度6-BA與NAA對原球莖的誘導(dǎo)率影響有顯著差異,并且呈負相關(guān)(分別為r=-0.716,r=-0.473),6-BA與NAA濃度越高原球莖的誘導(dǎo)率就越低。不同濃度2,4-D對原球莖的誘導(dǎo)率影響差異不顯著(P=0.312),但是低濃度的NAA誘導(dǎo)原球莖的時間比較長,高濃度的NAA處理誘導(dǎo)原球莖較松散,同時會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。因此原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L,原球莖誘導(dǎo)率可達86.67%。2.3激素4-ba和naa對鐵皮石斛原球莖增殖系數(shù)的影響6-BA對原球莖增殖系數(shù)影響顯著差異(P=0.002),6-BA濃度與原球莖的增殖系數(shù)呈正相關(guān)(r=0.918),隨著6-BA濃度的升高,增殖系數(shù)增大(圖1),不同濃度NAA對增殖率影響差異不顯著(P=0.8),但NAA濃度過高會使無菌苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,不利于原球莖的增殖。激素6-BA3.0mg/L與NAA0.3mg/L組合對鐵皮石斛原球莖增殖的效果較好,增殖系數(shù)高,分化苗生長正常(圖2)。所以確定原球莖增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。3最佳原球莖增殖培養(yǎng)的篩選目前,鐵皮石斛組織培養(yǎng)中采用的外植體有種子、莖段、葉、根尖等。鐵皮石解以種子作為外植體進行培養(yǎng)的研究較多,但是關(guān)于鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)的研究主要是通過莖尖、莖段、幼葉、種子等作為外植體→不定芽→原球莖的誘導(dǎo)方式。但以鐵皮石解莖段作外植體直接誘導(dǎo)原球莖的研究不多。以鐵皮石斛嫩莖為外植體,70%的酒精進行表面消毒3s,再用0.1%HgCl2浸泡8min,接種到原球莖誘培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L中,接種15~20天后萌動,莖段膨大,切面及頂部形成疏松組織,繼續(xù)培養(yǎng)后膨大的組織表面形成凸凹不平的顆粒物。隨著培養(yǎng)時間的延長,顆粒物會形成類原球莖顆粒物,再將其轉(zhuǎn)入到增殖培養(yǎng)基中,原球莖增殖的同時也可以分化出芽點。原球莖誘導(dǎo)時間為30天左右,誘導(dǎo)出原球莖后要適時轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中,如果培養(yǎng)時間過長就會產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。激素的種類與濃度對鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)是至關(guān)重要的。6-BA與NAA是影響鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)的主要因素,低濃度的6-BA與NAA有利于原球莖的誘導(dǎo),這與張治國的研究結(jié)果不同,可能是由于原球莖誘導(dǎo)途徑不同引起的差異。2,4-D在誘導(dǎo)原球莖的過程中雖然不是必要激素,但其能夠縮短誘導(dǎo)時間,加快原球莖的增殖。在含有高濃度6-BA與低濃度NAA的MS培養(yǎng)基上,原球莖增殖與芽分化是同時進行的,這與鄭志仁等的研究結(jié)果一致。在一定范圍內(nèi),高濃度6-BA對原球莖的增殖效果較好,同時適當(dāng)?shù)募尤隢AA(0.3mg/L),可使芽生長健壯。因此,原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。從鐵皮石斛植株上切下長2~5cm的幼嫩莖段,清水浸泡15~30min后,用刷子蘸少許洗衣粉水溶液輕輕刷洗,再用自來水充分洗凈并用紗布吸干水分。在超凈工作臺上將莖段放置在70%的酒精中浸泡3s后,用0.1%HgCl2,2%NaClO或10%H2O2浸泡,消毒后再用無菌水沖洗5~6次后,無菌濾紙或紗布吸干外植體上的水分,豎直插入MS培養(yǎng)基中。試驗設(shè)17個處理(表1),每個處理接種15瓶,每瓶只接種1個嫩莖,接種后15~45天內(nèi),每3天觀察1次,統(tǒng)計感染率及生長情況。以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同的激素:6-BA,NAA,IBA,2,4-D,KT。試驗設(shè)計見表2,篩選出適合原球莖誘導(dǎo)的激素種類,再進行激素濃度選擇的正交試驗如表3。嫩莖經(jīng)過消毒后,接種在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,30天后觀察原球