海帶褐藻糖膠磺化工藝研究【摘要】目的優(yōu)選海帶褐藻糖膠(FPS)磺化的工藝。方法以氯磺酸－N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為磺化試劑，采用正交設(shè)計(jì)法,考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及磺化劑用量對(duì)海帶褐藻糖膠磺化反應(yīng)的影響,找出制備高硫酸根含量海帶褐藻糖膠的最佳方法。結(jié)果反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)海帶褐藻糖膠的磺化有顯著影響(

【關(guān)鍵詞】海帶褐藻糖膠磺化硫酸根

Abstract:ObjectiveToexploretheoptimummethodforpreparationofsulfatedfucoidanextractedfromLaminariajaponica.MethodsUsingchlorsulfonicacidandDMFassulfatedreagent,testtheeffectofreactiontime,reactiontemperatureandvolumnofsulfatedreagentbytheorthogonaldesignmethod.ResultsReactiontimeandreactiontemperaturewerethesignificantfactors(<P<).hadwasReactionandtemperaturearesignificantfactors(<P<).Volumnofreagenthassomeeffectsonsulfation(<P<).Thebestprocesssetasfollows:thereactiontimeis3hat50℃with25mlsulfatedreagent.

Keywords:Laminariajaponica；Fucoidan；Sulfation；Sulfategroup

硫酸酯化多糖又稱多糖硫酸酯，是多糖的衍生物。近年來研究表明,多糖經(jīng)硫酸化后,本身富含硫酸根,易與蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合,由此改變其構(gòu)像并影響其功能,使其具有多種生物活性,如增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒等,特別是抗艾滋病病毒活性引起許多研究者的極大興趣，使硫酸酯化多糖的研究成為多糖研究領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)新熱點(diǎn)［1］。

褐藻糖膠又稱褐藻多糖硫酸酯,是一種含有硫酸基的陰離子雜聚糖,一般存在于褐藻和一些棘皮動(dòng)物體中,具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗?jié)兊泉?dú)特的生物活性,近年來成為海洋藥物的研究熱點(diǎn)之一［2，3］。研究表明硫酸根的含量與生物活性有密切的關(guān)系。SatoruK等［4］研究了從墨角藻中提取的褐藻糖膠的抗腫瘤活性,結(jié)果表明過硫酸化的褐藻糖膠的抗腫瘤活性顯著高于原料褐藻糖膠。以氯磺酸－吡啶為磺化試劑制得的褐藻糖膠的過硫酸化產(chǎn)物的抗凝血活性是原料的4倍［5］。從褐藻海黍子中提取的褐藻糖膠,磺化后,其高硫酸根組分對(duì)L－1210白血病有效果［6］。Haroun-BouhedjaF等［7］研究了從泡葉藻中提取的褐藻糖膠的生物活性,發(fā)現(xiàn)雙硫取代的樣品對(duì)抗凝血活性貢獻(xiàn)較大,當(dāng)硫酸根與褐藻糖的比值大于時(shí),抗凝血活性效果較好。

海帶Laminariajaponica是褐藻門海帶目海帶屬的一種大型海藻,含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素和礦物質(zhì),是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的天然保健食品。從海帶中提取出的褐藻糖膠也有許多獨(dú)特的生物活性。我們前期的研究工作表明提高硫酸根的含量可以提高其體外抗氧化能力。因此本實(shí)驗(yàn)就海帶褐藻糖膠的磺化反應(yīng)進(jìn)行了研究,考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及磺化劑用量對(duì)產(chǎn)物硫酸根含量的影響,從而優(yōu)化海帶褐藻糖膠的磺化工藝。

1材料與儀器1樣品

干海帶,購(gòu)于青島沙子口。2試劑

甲酰胺(AR)；N,N－二甲基甲酰胺(AR)；氯磺酸(AR)；95%乙醇；濃鹽酸(AR)；明膠(AR)；氯化鋇(AR)；氯化鉀(AR)；氯化鎂(AR)。3儀器

高壓鍋；FA1004電子天平；722型分光光度計(jì)；瑞士BüCHIR－114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；東京理化EYELAFD－5N型真空冷凍干燥機(jī)；電熱恒溫水浴鍋；TDL－40B離心機(jī)。

2方法

海帶褐藻糖膠的提取將干海帶用自來水清洗,除去泥沙,烘干,塑料袋封口室溫下保存。取上述干海帶100g,粉碎,用20倍蒸餾水在高壓鍋中提取3h,過濾,濾液加mol/L氯化鎂和20%的乙醇沉淀,硅藻土過濾,加活性炭在沸水浴中脫色30min,硅藻土過濾,濾液中加%KCl和75%乙醇沉淀,離心,將沉淀在紅外燈下烘干即得褐藻糖膠(FPS)［8］。

海帶褐藻糖膠磺化方案設(shè)計(jì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和磺化劑用量作為考察因素,每個(gè)因素?cái)M定3個(gè)水平,選用L9正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表1正交實(shí)驗(yàn)因素水平

海帶褐藻糖膠的磺化反應(yīng)

磺化試劑SO3－DMF的制備在冰浴中將50ml氯磺酸緩慢滴加到300mlN,N－二甲基甲酰胺中，滴加完畢后室溫?cái)嚢?0min，倒入棕色瓶中閉光保存。

磺化反應(yīng)稱取干燥的海帶褐藻糖膠樣品2g，倒入干燥的250ml三口瓶中，加入80ml甲酰胺，不同反應(yīng)溫度下機(jī)械攪拌30min，滴加不同劑量的磺化試劑SO3－DMF，反應(yīng)指定時(shí)間。反應(yīng)完畢后,將反應(yīng)液倒出，在%KCl存在下,用75%乙醇沉淀,并用95%乙醇洗滌沉淀2～3次，將沉淀在紅外燈下烘干，溶于100～150ml蒸餾水中，用2mol/LNaOH中和到pH為～，3600Da透析袋透析，自來水透析2d，蒸餾水透析1d。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100ml，真空凍干［9］。

原料及磺化樣品硫酸根含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1g明膠加100ml蒸餾水于60～70℃溶解，并在4℃下過夜，第2天把g氯化鋇溶于溶液中，靜置2h后使用。將硫酸鉀于105～110℃烘3h，放干燥器中冷至室溫，準(zhǔn)確稱取35mg左右，配成100ml溶液。配取標(biāo)準(zhǔn)液硫酸鉀分別為0，,，，，，ml，加蒸餾水定容至3ml，加mol/LHClml，明膠氯化鋇1ml，充分搖勻，放置30min后于500nm處測(cè)其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)硫酸鉀濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),數(shù)據(jù)處理得到硫酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=9X+，r=6。硫酸根濃度在～mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［10］。

原料及磺化樣品硫酸根含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱取各種條件制備得到的磺化樣品g左右放入安瓿瓶中，加2mol/LHCl8ml，待樣品溶脹后，封管，在鍋中水浴加熱4h，取出冷至室溫。把樣品從安瓿瓶中取出，放入小燒杯中加氨水中和至pH=～后加活性炭，放置一段時(shí)間后用濾紙過濾，用蒸餾水慢慢少量沖洗，但不要超過25ml，然后定容至25ml。取樣品溶液250μl，加蒸餾水定容至3ml，加mol/LHClml，明膠氯化鋇1ml，充分搖勻，放置30min后于500nm處測(cè)其吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得出樣品中硫酸根的含量。

3結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2～3。直觀分析得到，海帶褐藻糖膠磺化反應(yīng)的影響因素大小順序?yàn)锽CA，即反應(yīng)溫度磺化劑用量反應(yīng)時(shí)間；最佳的磺化工藝為A2B1C3，即反應(yīng)溫度為50℃，用25ml磺化劑反應(yīng)3h。方差分析可知溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響，磺化劑用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響。表2級(jí)差分析表3方差分析

平行實(shí)驗(yàn)及與原料褐藻糖膠中硫酸根含量的比較

以最佳磺化方案A2B1C3做3次平行實(shí)驗(yàn)，磺化樣品中硫酸根含量為%，原料褐藻糖膠中硫酸根含量為%，即通過磺化反應(yīng)使樣品的硫酸根含量提高了%。

4結(jié)論

磺化后樣品硫酸根含量比原料提高%，說明用SO3－DMF作為磺化試劑對(duì)褐藻糖膠進(jìn)行磺化是可行的，從而避免了使用毒性較強(qiáng)的SO3－吡啶作為磺化試劑，方法簡(jiǎn)單，可用于制備保健品和藥品。實(shí)驗(yàn)得到的海帶褐藻糖膠磺化的最佳方案：2g樣品溶于80ml甲酰胺中，用25mlSO3－DMF磺化劑在50℃反應(yīng)3h。

【參考文獻(xiàn)】

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