光對煙草修養(yǎng)成分及物質(zhì)代謝的影響

這是植物生長的重要因素之一，超過90%的干物質(zhì)來自光合作用。卷煙是一種耐旱的葉子植物，對植物的生長和發(fā)育的影響尤為重要。光能影響葉片的碳結(jié)合作用，改變?nèi)~片結(jié)構(gòu)和葉脈含量，激活或抑制各種與生長發(fā)育相關(guān)的酶的活性，改變養(yǎng)分代謝和次生代謝的生理強(qiáng)度和方向，最終影響葉片的產(chǎn)量、形狀和質(zhì)量特征。莖是植物表面的一個(gè)特殊官，具有“受刺激器”和“分泌器官”的雙重功能。它不僅能感覺外部環(huán)境的微妙刺激，還能誘導(dǎo)各種抗反應(yīng)，分泌重要的氣味前體物質(zhì)，提高葉片的質(zhì)量。之前，關(guān)于卷煙和植物血漿的光因子研究主要集中在傅體密度和表面活性劑的含量上，但很少報(bào)告光度以及毛主席的發(fā)育和物質(zhì)代謝。分析其原因可能是由于毛體的獨(dú)特生理位置和結(jié)構(gòu)的研究。在本試驗(yàn)中，選擇具有波動育種期條件的香煙，控制光照度，采用改進(jìn)的毛囊分離提取技術(shù)，確定高純度的毛發(fā)和冠層植物。在不同的光度處理下，不同程度的光對側(cè)的濃度、形狀、物質(zhì)分泌以及毛囊雙層合成的重要遺傳因素的形態(tài)強(qiáng)度存在差異。光度對預(yù)防和轉(zhuǎn)化毛羽的影響。1材料和方法1.1光照度試驗(yàn)與大田期開放式的環(huán)境相比,室內(nèi)(或棚內(nèi))育苗期的環(huán)境更容易被調(diào)節(jié)和掌控,因此,試驗(yàn)以苗期的K326為材料,依照《優(yōu)質(zhì)煙栽培技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行催芽和漂浮育苗,于苗齡45d(大十字期)時(shí)將煙苗分組進(jìn)行光照度試驗(yàn).1.2測試方法1.2.1中間光照度控制光周期恒定(12h光照/12h黑暗),按光照度不同分為3組處理:處理1:高光照度15380lx;處理2:中間光照度9610lx;處理3:低光照度7500lx.試驗(yàn)過程中室溫規(guī)律一致(白天26℃/夜間22℃),各組煙苗均為36株,試驗(yàn)處理30d后混合取樣,光照度值均使用DigitalLuxMeterAR823(SmartSensor公司,中國香港)儀器測得.1.2.2葉片表面毛細(xì)效應(yīng)取處理煙株第1片新葉(葉長10cm),用鑷子直接撕取葉脈一側(cè)下表皮在MOTIC光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)腺毛密度.從葉脈另一側(cè)切下約5mm×8mm的平整葉片小塊,使用NikonSMZI500體視顯微鏡(Nikon公司,日本)觀察葉片表面腺毛形態(tài)并拍照.1.2.3色譜法制備待測液西柏烷類物質(zhì)是腺毛分泌物的主要成分,參考蔡莉莉等的提取方法并進(jìn)行改良,對處理后的葉表腺毛分泌物進(jìn)行提取.稱取0.400g煙葉凍干粉末,置于40mL色譜瓶中,加入0.5mL內(nèi)標(biāo)溶液(1.2125g正十八烷醇、1.0005g蔗糖八乙酸脂的500mL二氯甲烷溶液),加入10mL乙腈,超聲萃取10min后加入無水硫酸鈉適量除水,用移液槍移取1mL上清液加入到1.5mL的色譜瓶中,然后用氮?dú)獯蹈?向吹干后的1.5mL色譜瓶中加入DMF和BSTFA各250μL,在75℃水浴中進(jìn)行衍生化反應(yīng)60min,取出來后加入吡啶和N,O-雙乙酰胺各125μL完全溶解,即為待測液.待測液用GC/MS與微機(jī)聯(lián)用進(jìn)行定性、定量分析.色譜儀型號HP-5890,質(zhì)譜儀型號vc-70SE.色譜柱:DB-5MSUI石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.);進(jìn)樣口溫度:250℃;程序升溫:40℃保持2min,然后以6℃·min-1升溫至180℃保持2min,以2℃·min-1升溫至280℃保持20min;載氣:高純氦氣;載氣流速:恒流0.8mL·min-1;進(jìn)樣量:1.0μL;分流比:15∶1.MS條件:傳輸線溫度250℃;EI離子源溫度280℃;電離能量70eV;質(zhì)量數(shù)范圍50~650amu;檢索譜庫NIST08.結(jié)果經(jīng)Excel計(jì)算扣除內(nèi)標(biāo)整理成圖表.1.2.4rt-pcr檢測煙草核糖干預(yù)變性葉面腺毛的提取參考ERMING等的方法并進(jìn)行改良.選取幼嫩健康的葉片液氮中低溫固定形態(tài)5min,使用硬度適中的毛刷由葉基向葉尖方向?qū)⑾倜⒅潦⒂羞m量液氮的研缽中,每個(gè)樣品刷取約100cm2的葉片,刷取完成后直接研磨提取.RNA提取使用QIAGEN公司的MiniKit試劑盒,反轉(zhuǎn)錄使用NEWBIOINDUSTRY公司生產(chǎn)的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于RT-PCR檢測.引物設(shè)計(jì)采用PremierPrime5.0軟件,根據(jù)Genbank發(fā)布的L25,DXR,CBT和CYP71D16序列設(shè)計(jì)各基因擴(kuò)增引物(表1),進(jìn)行RT-PCR.其中L25是煙草核糖體蛋白,本研究中作為內(nèi)參基因.PCR反應(yīng)體系為20μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃5min預(yù)變性;94℃30s變性,48~51℃30s退火(具體按各引物Tm值設(shè)定),72℃1min延伸,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測,并觀察拍照.2結(jié)果與分析2.1中間光照度對腺頭激素含量的影響選擇生長發(fā)育一致的煙苗在不同光照度下處理30d,對葉面腺毛進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出,3種光照度下葉片腺毛結(jié)構(gòu)相似,多為長柄多細(xì)胞腺頭腺毛,柄細(xì)胞為3~5個(gè),腺頭細(xì)胞1~3個(gè).但高光照度下腺毛個(gè)體較大,柄細(xì)胞發(fā)達(dá),腺頭多為單細(xì)胞,內(nèi)含物少,顏色淺淡(圖1-A);中間光照度下腺毛柄較細(xì)弱,腺毛腺頭發(fā)育充分,腺頭細(xì)胞多,細(xì)胞質(zhì)充盈,顏色呈現(xiàn)深綠色,表明葉綠體發(fā)達(dá),葉綠素含量較高(圖1-B);低光照度下腺毛腺頭多為單細(xì)胞,還有一定數(shù)量的葉綠體,但胞質(zhì)不飽滿(圖1-C).不同光照度下腺毛密度統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(圖1-D),中間光照度下腺毛密度極顯著高于低光照度和高光照度,并以長柄腺毛的差異為主,短柄腺毛在不同光照度下差異并不顯著;低光照度下的葉面腺毛密度略高于高光照度下,但兩者之間沒有顯著差異.2.2不同光照度葉片中西柏三烯二醇的分離效果腺毛分泌西柏烷類化合物的組分中以西柏三烯二醇含量為最高,占葉面化學(xué)物質(zhì)的60%~80%,其分泌量與腺毛類型、密度及發(fā)育狀態(tài)關(guān)系密切.采用GC/MS技術(shù),對不同光照度下葉片中西柏三烯二醇進(jìn)行檢測分析,結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出,α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的比例在不同光照度下大致相同,大約為后者的3倍;在中度光照度下西柏三烯二醇含量為最高,其次是高光照度,低光照度下西柏三烯二醇含量為最低,這說明光照度較高和較低均對腺毛分泌產(chǎn)生了抑制.2.3醇合成酶系統(tǒng)脫氧磷酸木酮糖還原異構(gòu)酶(DXR)催化脫氧磷酸木酮糖形成甲基赤鮮糖醇-4-磷酸,是雙萜和四萜代謝前體物質(zhì)———IPP合成的關(guān)鍵酶基因;西柏三烯一醇合成酶(CBT)可以催化牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(GGPP)向西柏三烯一醇的轉(zhuǎn)化生成;而西柏三烯二醇合成酶(CYP71D16)則可催化西柏三烯一醇向西柏三烯二醇轉(zhuǎn)化:3種酶與西柏烷類分泌物的合成密切相關(guān).以不同光照度處理的葉片為材料,刷取葉面腺毛,利用RT-PCR技術(shù)檢測DXR,CBT,CYP71D16基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化,結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出,低光照度下與西柏三烯二醇合成相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)更為活躍.3高光照度對腎上腺素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響本試驗(yàn)對不同光照度下煙苗葉面腺毛的比較研究證明,光照度對腺毛發(fā)育及物質(zhì)代謝有較大影響.中間光照度處理下,葉面腺毛密度大,腺頭細(xì)胞發(fā)育充分,西柏烷類化合物含量較高.光照過強(qiáng)或過弱,腺毛密度及生長發(fā)育都受到負(fù)影響.低光照度下,腺毛密度明顯降低,腺頭細(xì)胞發(fā)育受阻,得西柏烷類化合物含量均較低.翁夢苓等研究也發(fā)現(xiàn),在大田遮蔭條件下煙株葉面腺毛密度較小,腺毛葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)烈,但腺毛分泌物含量卻明顯降低,與本研究結(jié)果一致.高光照度下,腺毛密度也有所降低,雖然腺毛柄細(xì)胞比較發(fā)達(dá),但腺頭細(xì)胞明顯發(fā)育遲緩,尤其是葉綠素含量明顯較低,這或許是因?yàn)楫a(chǎn)生了“光抑制”.王瑞等和江力等的研究均表明,高光照度下葉片PSⅠ,PSⅡ及全電子傳遞活性和碳酸酐酶(CA)活性下降,光合能力下降.而本研究證實(shí)高光照度對腺毛的形態(tài)發(fā)生及物質(zhì)代謝也有一定的抑制作用.對腺毛基因表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn),腺毛中西柏烷類化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)與物質(zhì)含量之間并不呈現(xiàn)緊密相關(guān)性.雖然低光照度下DXR,CBT,CYP71D16基因的表達(dá)水平最活躍,但中間光照度下西柏烷化合物含量最高.推測有2個(gè)方面的原因:一方面,光照度對腺毛密度、腺頭細(xì)胞發(fā)育和分化的影響大于對腺