大豆根際生防菌對2種病原菌的防治效果

由于富澤細菌（fusariumspp.）引起的大豆根腐病是一種廣泛發(fā)生、嚴重影響和難以控制的全球疾病，其中美國、加拿大、日本和中國等地發(fā)生了嚴重病例。在加拿大東部地區(qū)大豆根部分離的主要鐮孢菌為尖鐮孢菌(F.oxysporumcomplex)、茄腐鐮孢菌(F.solanicomplex)、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichoides)、三線鐮孢(F.tricinctum)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)和木賊鐮孢菌(F.equsiti)。經(jīng)課題組鑒定尖鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、燕麥鐮孢菌和三線鐮孢菌對大豆根部均具有很強的致病性。目前輪作是加拿大大部分農(nóng)場主要耕作方式,在加拿大東部地區(qū)大豆主要與禾本科作物輪作,可降低病害的發(fā)生,充分利用土壤資源,持續(xù)提高作物產(chǎn)量。然而鐮孢菌也是引起禾谷類作物根部的主要病原菌,其中澳大利亞、法國、新西蘭、加拿大、美國和中國都有嚴重發(fā)病的報道。在不同的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,鐮孢菌的種類、優(yōu)勢種群和致病性存在很大差異,致使輪作系統(tǒng)中禾谷類作物根部的致病鐮孢菌也給大豆帶來威脅。該研究分別測試不同來源的生防菌株對尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌引起的根腐病的防治效果及對大豆生長的影響,以篩選抑菌范圍廣、防治效果好、促生作用和定殖能力強的生防菌處理。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1生防菌及菌株病原菌:尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌分離于加拿大渥太華中心試驗農(nóng)場。生防菌:生防菌株見表1,其中粉紅螺旋聚孢霉ACM941對菜豆根腐病致病性鐮孢菌有很好的拮抗作用,細菌菌株SB24課題組已研究證明對鐮孢菌具有很好的控制效果。1.1.2材料1:牛肉膏PDA培養(yǎng)基:39gPDA試劑溶于1L水中。NA培養(yǎng)基:牛肉浸膏3.0g;蛋白胨10.0g;NaCl5.0g;瓊脂20g;水1000mL;pH7.0。麥粒培養(yǎng)基:麥粒60%含水量浸泡12h滅菌1h后待用。1.1.3大豆品種1.2測試方法1.2.1鐮孢菌種的制備參照Xue等的方法,大豆種子用10%次氯酸鈉(NaClO)表面消毒1min,用蒸餾水反復清洗4次,種子平鋪在滅菌吸水紙上再放到培養(yǎng)皿內(nèi),室溫條件下培養(yǎng),每隔12h噴無菌水,發(fā)芽后待用。將分離出的鐮孢菌分別在PDA培養(yǎng)基中25℃恒溫培養(yǎng)7d,用打孔器打取直徑為2mm的菌片待用。滅菌的吸水紙折疊多層剪成小塊,將吸水紙用無菌水浸透,把發(fā)芽48h的種子置于滅菌紙中央,挑取培養(yǎng)好的鐮孢菌菌片接種到萌發(fā)種子的根毛區(qū)。接種后的植株放在雙層滅菌紙中折起,然后用鋁箔紙包裹起來。底部浸在蒸餾水中以便種子吸水,頂端打開利于植物生長。將包好的鋁箔紙放在小的淺盤里,然后將其置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d。每天檢測吸水紙中的含水量,按需水量加水。1.2.2病原菌抗菌劑的制備研究測試12個真菌菌株(HJ-ZT2、CH-Tr51、HJ-MM35、CH-Tr14、HJ-ZT1、CH-Tr18、HJ-MM8、CH-Tr9、HJ-MM7、CH-Tr12、HJ-MM9、ACM941)對2株病原菌的拮抗能力,從生長7d的病原菌菌落邊緣打取直徑5mm菌餅,放在PDA平板的一側(cè),同樣大小的生防菌菌餅放于相距7.5cm處。對照只接尖鐮孢菌。25℃黑暗培養(yǎng)7d,每個處理4次重復,2次重復試驗。計算抑制率I=R1/R2(R1為對峙培養(yǎng)皿中尖鐮孢菌面對生防菌所生長的距離、R2為對照皿中尖鐮孢菌生長的距離)。1.2.3生防真菌制劑的制備菌種擴繁:量取一定量的麥粒放在容器中,用水反復清洗干凈,加入足夠量的水浸泡12h。濾出水后在121℃的滅菌鍋里滅菌60min,冷卻后將PDA上培養(yǎng)的鐮孢菌接種到麥粒培養(yǎng)基中,在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d即可接種使用。生防菌劑制備:PDA平皿上活化的生防真菌培養(yǎng)7d,用無菌水依次稀釋配制成107cfu·mL-1孢子懸浮液,將配制好的菌懸液與褐煤載體按1∶10的比例配成生防真菌制劑,再將生防真菌制劑和大豆種子按1∶10的質(zhì)量比進行拌種,自然風干后待用。生防細菌菌劑的制備是將細菌用NA培養(yǎng)基活化2d,后將其接入液體NA培養(yǎng)基,25℃搖瓶培養(yǎng)2d,其它方法同真菌。盆栽試驗:試驗設(shè)計為隨機區(qū)組設(shè)計,共設(shè)16個生防處理,單菌制劑為HJ-ZT2、CH-Tr51、HJ-MM35、CH-Tr14、HJ-ZT1、CH-Tr18、HJ-MM8、CH-Tr9、HJ-MM7、CH-Tr12、HJ-MM9、ACM941、復配菌劑為ACM941+HJ-MM7、SB24+ACM941和SB24+HJ-MM7,設(shè)分別只接尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌為對照、Vitaflo280藥劑拌種為化學對照,每個處理4次重復。生防菌劑按土壤質(zhì)量的5%接種到土壤中,混合均勻后播入已消毒的大豆種子8粒,25℃晝夜交替溫室條件培養(yǎng),30d后調(diào)查株高、鮮重和發(fā)病情況,發(fā)病情況的分級標準參照陳宗澤等,2次重復試驗。1.2.4生防菌試驗及接種量試驗試驗于2008年在加拿大禾谷類和油料作物研究所中心試驗農(nóng)場進行,土壤分別接種尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌,鐮孢菌菌劑的接種量是100g·m-2。生防菌處理和接種方式與溫室試驗相同。采用隨機區(qū)組設(shè)計,每個處理4次重復,30d后調(diào)查出苗率,收獲期調(diào)查病害嚴重度、株高、各產(chǎn)量性狀及大豆產(chǎn)量。各指標較對照增加值計算均為:(處理-對照)/對照。1.2.5統(tǒng)計分析2結(jié)果與分析2.1芽孢桿菌的致病性尖鐮孢菌使大豆根部產(chǎn)生大面積黑色病斑甚至整個根部壞死。禾谷鐮孢菌的致病性從癥狀看要輕于尖鐮孢菌,它在根部形成黑色或紅色病斑,根的伸長生長不會受到抑制且有些植株發(fā)病癥狀很輕。該試驗中對照在PDA培養(yǎng)基接觸的根部,顏色變暗,但與病斑有很大區(qū)別。2.2ch-tr18的抑菌效果實驗室控制條件下生防菌株對尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的拮抗效果差異不顯著(P<0.05),但不同生防菌的抑菌率差異顯著(P>0.05)。合并分析可知:HJ-ZT1、HJ-MM7、HJ-ZT2、CH-Tr14、HJ-MM8和CH-Tr18的抑菌率分別為70.4%、66.45%、68.27%、66.72%、64.53%和64.02%,顯著高于CH-Tr51、HJ-MM35、HJ-MM9和ACM941(圖2)。其中HJ-ZT1、HJ-MM7和HJ-ZT2生長速度較快,在與禾谷鐮孢菌和尖鐮孢菌的對峙試驗中HJ-ZT1和HJ-ZT2菌絲密集且將禾谷鐮孢菌菌絲覆蓋繼續(xù)生長,禾谷鐮孢菌菌絲被溶解而變得稀疏;HJ-MM7在交界處菌絲停止生長,孢子密集出現(xiàn)明顯的抑菌帶,鐮孢菌菌絲生長受到抑制。ACM941在平板試驗中生長速度較慢看不出對鐮孢菌的拮抗作用,而Xue等研究表明其在田間應用具有良好的抑菌效果,因此需進一步測試其抑菌能力。2.3生防菌對禾谷鐮孢菌的防治效果溫室條件生防菌處理對尖鐮孢菌和谷鐮孢菌的防效及促生作用均存在差異(表2)。CH-Tr12對尖鐮孢菌防治效果最好為72%,與ACM941、SB24+HJ-MM7和化學對照的防效差異不顯著。菌株HJ-MM35、CH-Tr12、ACM+HJ-MM7、SB24+ACM941、CH-Tr18和CH-Tr9可在很大程度上促進植株的生長。生防菌CH-Tr14、HJ-MM7和CH-Tr12對禾谷鐮孢菌防治效果較好,防效分別為37%38%、36%和36%,顯著高于HJ-ZT2和HJ-MM8;且與其它處理差異不顯著?；瘜W對照處理的大豆出苗率顯著高于其它處理,復配后的生防菌處理ACM941+HJ-MM7和SB24+ACM941可以使出苗率提高21%和23%。且CH-Tr18、CH-Tr9、ACM941和SB24+ACM941處理均較大程度的提高植株的根長、株高、根干重和地上部干重。2.4苯二氮素及其應用穩(wěn)定性表1由表3可知,田間土壤接種病原菌條件下生防菌對尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌引起的大豆根腐病防治效果差異不顯著(P<0.05)。合并分析可知ACM941+HJ-MM7使大豆增產(chǎn)10%,顯著高于ACM941和CH-Tr51。其中CH-Tr14增產(chǎn)9%,CH-Tr12為8%,CH-Tr18和化學藥劑均增產(chǎn)6%。這表明化學藥劑在苗期防治效果較好,但田間持效性差,而生防制劑持效性長,田間產(chǎn)量增加幅度大。HJ-MM7、CH-Tr12、HJ-MM9和SB24+HJ-MM7使出苗率有所降低,但均可提高大豆產(chǎn)量,可能由于出苗率相對較低的大豆在空間和營養(yǎng)競爭上占優(yōu)勢,同時生防菌在后期大量繁殖對植株具有一定的保護作用,從而促使植株生長旺盛表現(xiàn)出增產(chǎn)效果。3討論3.1生防菌株協(xié)同保鮮目前大豆根腐病生防菌株主要分離于大豆根部及根際土壤,該研究在輪作系統(tǒng)中分離于小麥根部及根際土壤的生防菌株對大豆根部致病性尖鐮孢菌和禾谷鐮孢菌均有抑制作用,因此輪作系統(tǒng)中不同作物根際生防菌株均可進行生物防治研究,這拓寬了生防菌株的采集范圍。大豆根腐病是多種病原菌復合侵染,生防菌復配在一定栽培條件下更能適應不同的土壤、多種病原菌和環(huán)境變化,從而減輕病害發(fā)生程度,促進植株的生長發(fā)育。利用復配菌株處理不是簡單的累加,而有一定的協(xié)同作用,充分發(fā)揮不同菌株的生防機制,起到防病增產(chǎn)的作用。來源于不同植物根際的生防菌復配,也可有效防治輪作系統(tǒng)中相同病原菌引起的病害。3.2對大豆生防菌的控制生防菌在不同試驗條件下對2種鐮孢菌的防治效果存在差異。平板拮抗試驗中2種鐮孢菌生長速度相近,生防菌對2種鐮孢菌表現(xiàn)的拮抗能力差異不顯著。溫室盆栽條件,生防菌對尖鐮孢菌的防治效果要高于禾谷鐮孢菌,這是由于尖鐮孢菌的致病性較強,在相同接種劑量的溫室條件尖鐮孢菌引起大豆根腐病發(fā)病重,因此生防菌防治效果明顯,這與目前研究結(jié)果一致。田間接種試驗是在復雜的土壤條件下進行,多年大豆田間分離病原菌結(jié)果可知尖鐮孢菌的分離頻率明顯高于禾谷鐮孢菌,接種病原菌后尖鐮孢菌仍為優(yōu)勢種群,因此生防菌處理對2種鐮孢菌的防治和增產(chǎn)效果