木霉菌株d31對立枯絲核菌的拮抗作用

屬于半知菌亞門的絲桿菌屬（psp）。集體甘醇菌屬于半知菌亞門。這是一種常見的生態(tài)環(huán)境，如土壤、根、葉、種子和莖。木霉菌是植物病害重要的生防菌,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)、綠色木霉菌(T.viride)、康氏木霉菌(T.koningii)、鉤狀木霉菌(T.hamatum)和長枝木霉菌(T.longibrachiatum)等對多種植物病原菌表現(xiàn)拮抗活性。不同的木霉菌生防機制不盡相同,一般認(rèn)為競爭作用、重寄生作用、產(chǎn)生降解病原真菌細(xì)胞壁的水解酶是木霉菌主要的生防機制。隨著木霉菌生防機制研究的不斷深入,抗生物質(zhì)等木霉菌代謝物的拮抗作用受到關(guān)注。木霉菌產(chǎn)生的抗生物質(zhì)多為次級代謝產(chǎn)物,具有菌株的特異性,不同菌株的代謝產(chǎn)物不盡相同。這些抗生物質(zhì)包括了戊酮、辛酮、類萜、多肽和氨基酸衍生物等幾大類。同時還發(fā)現(xiàn)綠色木霉能產(chǎn)生可揮發(fā)性的次級代謝產(chǎn)物,通過影響其他真菌的蛋白質(zhì)合成和生長速度起到抑菌作用。研究木霉菌產(chǎn)生的這些拮抗性代謝產(chǎn)物將對新型生防制劑創(chuàng)制具有重要意義。立枯絲核菌是重要的土傳植物病原真菌之一,可引起多種作物的立枯病和根腐病,為了明確木霉菌株Td31代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的拮抗作用,并為深入研究木霉菌拮抗機制和代謝產(chǎn)物開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù),本試驗研究了木霉菌株Td31代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌菌絲生長和菌核形成等方面的影響。1材料和方法1.1巷道品種—材料供試木霉菌株Td31和立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)菌株Rs由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物室選育;供試茄子(Solanummelongena)品種濟農(nóng)2000由濟南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供;供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、麩皮培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基(NH4NO33g、葡萄糖45g、K2HPO41.5g、KCl0.75g、MgSO4·7H2O0.75g、FeSO4·7H2O0.015g、水1L、pH=6),每個500mL的三角瓶中裝100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基,121℃滅菌30min。1.2培養(yǎng)方子懸浮液試驗于2007年3~12月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。每瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種8×106個孢子·mL-1的木霉菌孢子懸浮液2mL,置QYC2112雙層全溫?fù)u床上,25℃、180r·min-1培養(yǎng)5d。以此培養(yǎng)物為種子,按6%的接種量接入10L不銹鋼全自控發(fā)酵罐,25℃液體深層發(fā)酵11d。發(fā)酵液用細(xì)菌過濾器抽濾,濾液一部分直接轉(zhuǎn)入無菌的三角瓶中4℃保存?zhèn)溆?簡稱A液,下同),另一部分121℃滅菌20min,保存?zhèn)溆?簡稱B液,下同)。1.2.1生長曲線測定培養(yǎng)條件用融化的PDA培養(yǎng)基分別將A液、B液稀釋成1,5,10,20倍,制成含不同濃度A液和B液的PDA平板。在平板中央分別接0.6cm的立枯絲核菌菌絲餅,以液體發(fā)酵培養(yǎng)基同比稀釋的PDA平板接種立枯絲核菌為對照,25℃下培養(yǎng),每天觀察、記錄立枯絲核菌的生長情況,測量菌落直徑直至對照長滿平板(處理5d),并計算抑菌率,抑菌率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100,試驗設(shè)3次重復(fù)。1.2.2培養(yǎng)立枯絲核菌用滴管在滅菌的載玻片中央滴一滴A液,然后用接種鉤挑取立枯絲核菌的菌絲放入其中,小心的將菌絲分散開,蓋上蓋玻片。同樣方法,制備B液試驗玻片。將制備好的玻片放于顯微鏡下連續(xù)觀察菌絲體和細(xì)胞的形態(tài)變化。用A液均勻的噴灑在用PDA培養(yǎng)7d的立枯絲核菌菌絲上。每隔2h挑取立枯絲核菌菌絲制片觀察菌絲的變化情況。1.2.3不同濃度a液和b液對培養(yǎng)立枯絲核菌核的影響發(fā)酵液對立枯絲核菌菌核形成試驗處理方法同1.2.125℃下培養(yǎng)至對照平板菌核大量形成,觀察、記錄不同濃度A液和B液處理對立枯絲核菌菌核形成的影響。將立枯絲核菌接入PDA培養(yǎng)基中,25℃下培養(yǎng)約20d至有大量菌核生成,用無菌水將A液分別稀釋成1,5,10,20倍液。無菌條件下將菌核挑出用不同濃度的A液浸泡30min,用無菌水沖洗5次,再用滅菌的濾紙吸凈殘液,然后把菌核接入PDA平板中,每個培養(yǎng)皿均勻分散放置10個菌核,每個濃度處理做3皿。B液處理同A液,以未浸泡的菌核接入PDA平板為對照。25℃下培養(yǎng),觀察、記錄菌核萌發(fā)情況。1.2.4立枯絲核菌誘導(dǎo)育苗用A液和B液原液和稀釋成5,10,20倍的稀釋液浸泡茄子種子約4h。盆栽試驗土壤用40%甲醛1L·m-3消毒,試驗地點在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站,4月26日播種。每個花盆中加入消毒土并接入立枯絲核菌麩皮培養(yǎng)物3g,充分混勻后播撒不同濃度發(fā)酵液處理的種子20粒。以接種立枯絲核菌而播種未用發(fā)酵液處理過的茄子種子作對照,每處理設(shè)3次重復(fù)。從出苗開始每天調(diào)查1次發(fā)病情況,共調(diào)查15d,統(tǒng)計健株數(shù)與病株數(shù),每次調(diào)查后清除病株。計算發(fā)病率和防治效果,發(fā)病率(%)=(死苗數(shù)/總出苗數(shù))×100,防治效果(%)=[(對照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/(對照發(fā)病率-空白對照發(fā)病率)]×100。2結(jié)果與分析2.1不同稀釋頻次木霉菌抑菌率結(jié)果木霉菌代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可強烈抑制RS的菌絲生長(表1)。以A液稀釋1倍處理的抑菌率最高,為87.7%;稀釋20倍時抑菌率低于50%,隨著木霉菌發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加,其抑菌效果隨之下降,差異極顯著。A液與B液對立枯絲核菌菌絲生長抑制作用的趨勢相同,只是B液比A液的作用強度略低。發(fā)酵液稀釋1倍處理培養(yǎng)5d后,RS菌絲消解并消失;發(fā)酵液稀釋5倍處理培養(yǎng)5d后,RS菌絲幾乎不再生長。2.2不同濃度木霉菌對枯絲核菌菌核萌發(fā)的抑制作用由表2可知,木霉菌代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可強烈抑制立枯絲核菌菌核的形成,隨著木霉菌發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加抑制效果逐漸下降,菌核形成量逐漸增加;稀釋20倍時菌核形成量與對照相近。不同濃度的木霉菌發(fā)酵液對立枯絲核菌菌核萌發(fā)的抑制效果不同,處理間差異極顯著。其中A液稀釋1倍處理對立枯絲核菌菌核萌發(fā)的抑制作用最強,菌核萌發(fā)率僅為43.3%,而對照菌核萌發(fā)率為100%。發(fā)酵液濃度越高,菌核的萌發(fā)率越低,但是發(fā)酵液尚不能完全抑制菌核的萌發(fā)。A液和B液在相同濃度下對菌核萌發(fā)率的影響差異不明顯。2.3b液質(zhì)及立枯絲核菌的菌落噴灑A液處理2h的立枯絲核菌菌絲原生質(zhì)濃縮;24h后有大量的細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)減少,細(xì)胞中出現(xiàn)小空泡,有的細(xì)胞中甚至看不到細(xì)胞質(zhì),僅剩細(xì)胞壁。A液作浮載劑顯微觀察發(fā)現(xiàn),大約2h后,菌絲細(xì)胞的原生質(zhì)濃縮(圖1-A),有的細(xì)胞質(zhì)變稀薄,24h后可觀察到立枯絲核菌的菌絲變形、原生質(zhì)濃縮并溢出(圖1-B),大多數(shù)菌絲僅見細(xì)胞壁,少數(shù)菌絲細(xì)胞中可見原生質(zhì),但是細(xì)胞質(zhì)稀少且聚集,出現(xiàn)大量的空胞(圖1-C)。48h后觀察發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌的菌絲細(xì)胞壁消解(圖1-D)。這說明木霉菌在發(fā)酵過程中,產(chǎn)生了大量的破壞立枯絲核菌菌絲的生物活性物質(zhì)。B液作浮載劑處理立枯絲核菌也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象,在變化進(jìn)程上略慢于A液處理,但是48h后未見菌絲消解(圖1-E,F,G)。處理48h對照未見變化(圖1-H)?？梢?木霉菌發(fā)酵液中的生物活性物質(zhì)經(jīng)高溫處理后仍具有很強的破壞立枯絲核菌菌絲的活性。2.4發(fā)酵液濃度對酵母粉病株率的影響由表3可知,不同濃度木霉菌發(fā)酵液浸種均可明顯降低立枯絲核菌引起的茄子立枯病病株率,差異極顯著;而且其防治效果隨發(fā)酵液濃度的增加而提高,發(fā)酵原液最高防效達(dá)69.8%,故高濃度下防治效果較為理想。A液和B液在相同濃度下對立枯絲核菌防治效果有一定差異,發(fā)酵濾液經(jīng)高溫滅菌后,防病效果略有下降但差異不顯著。3抗菌活性物質(zhì)木霉菌株Td31代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌有拮抗作用,其能破壞菌絲,使細(xì)胞中的原生質(zhì)濃縮、空胞化,細(xì)胞壁消解、細(xì)胞質(zhì)外溢、菌絲體變形、解體;木霉菌株Td31代謝產(chǎn)物能抑制立枯絲核菌菌絲的生長及菌核的形成和萌發(fā)。采用木霉菌株Td31發(fā)酵液浸種可以有效地防治立枯病,并且發(fā)酵液濃度越高,防病效果越好。過濾除菌的發(fā)酵液稀釋1倍處理菌絲生長抑菌率為87.7%,可完全抑制菌核的形成,菌核萌發(fā)抑制率為56.7%,發(fā)酵原液浸種對立枯病防效高達(dá)69.8%。隨著木霉菌發(fā)酵液濃度的降低其抑菌效果也隨之下降,差異極顯著。木霉菌株Td31產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)具有耐高溫性,121℃處理20min對拮抗活性無明顯影響。木霉菌株Td31是本課題組從抑病土壤中分離并經(jīng)誘變篩選獲得的一個木霉菌株,對立枯絲核菌、鐮刀菌、蘋果輪紋病菌和蘋果炭疽病菌等多種土傳病原真菌具有很強的拮抗作用,防治立枯病效果顯著。研究中發(fā)現(xiàn)該菌株代謝產(chǎn)生抑菌物質(zhì)是主要的生防機制,并且代謝產(chǎn)物抑菌活性強,熱穩(wěn)定性高。產(chǎn)生可以降解病原真菌細(xì)胞壁的水解酶是木霉菌生防機制之一,但是121℃處理20min能保持較高生物活性的木霉菌產(chǎn)生的胞壁水解酶目前尚未見報道,所以這種拮抗物質(zhì)不可能是酶,應(yīng)為一種或一類耐高溫的抗生素,一些相關(guān)研究也證實了這一點。孫彩云等發(fā)現(xiàn)木霉菌株SMF2產(chǎn)生的抗生物質(zhì)可以抑制細(xì)菌生長,將其孢子胞外分泌的抗生素命名為木霉素,并認(rèn)為這是抑制青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)生長的主要物質(zhì),該物質(zhì)對熱穩(wěn)定,將其100℃滅菌10min后仍有一定抑菌能力。曹翠玲等發(fā)現(xiàn)康氏木霉代謝物可使蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)菌絲干重明顯降低,培養(yǎng)濾液121℃濕熱滅菌30min與過濾滅菌處理相比,在同一濃度下對菌絲干重的影響在F0.05水平上無明顯差異。朱天輝等用木霉菌膠霉毒素生產(chǎn)發(fā)酵液靜置培養(yǎng)哈茨木霉(T.harzianum)菌株FO60,將發(fā)酵液分別濕熱滅菌及過濾滅菌后以一定體積比加入形成菌核的培養(yǎng)基中,接種等量的立枯絲核菌(Rsolani)后,均能抑制R.solani菌落生長和降低菌絲干重,濕熱滅菌后其抑菌效果與未滅菌物質(zhì)比較無明顯差異,表明其非揮發(fā)性物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性。哈茨木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以抑制立枯絲核菌菌絲的生長及菌核的形成,且隨時間增加有積累效應(yīng)。孫冬梅等在黃綠木霉代謝物中也發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性抑菌物質(zhì)存在,這些不同木霉菌產(chǎn)生的耐高溫抑菌物質(zhì)是否屬于同一種或者是同一類化學(xué)物質(zhì),尚有待于深入研究。拮抗作用顯微觀察發(fā)現(xiàn),過濾滅菌比高溫滅菌的發(fā)酵液破壞立枯絲核菌菌絲的速度快,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過濾滅菌的發(fā)酵液可檢測到幾丁質(zhì)酶活性,說明木霉菌株Td31拮抗作用雖然以產(chǎn)生耐高溫的抗生素為主,但同時可能也產(chǎn)生一些立枯絲核菌細(xì)胞壁降解酶類,以增強抗生素的拮抗作用。