西北農(nóng)林科技大學(xué)2008級本科畢業(yè)論文答辯

肉雞脂聯(lián)素基因真核表達載體構(gòu)建及其對脂肪代謝的影響答辯人：陳晨指導(dǎo)老師：孫超（教授）答辯日期：6月15日課題目的脂聯(lián)素是脂肪細胞特異性分泌的一種細胞因子，也是一種血漿蛋白，能夠調(diào)控生物體的能量穩(wěn)態(tài)和葡萄糖代謝和脂肪代謝，是至今發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負相關(guān)的脂肪細胞特異性蛋白。脂聯(lián)素是脂肪細胞表達最豐富的激素，在血漿中有相當(dāng)高的濃度。本試驗旨在通過構(gòu)建脂聯(lián)素的真核表達載體進而探討脂聯(lián)素對脂肪代謝的影響，為深入研究脂聯(lián)素與脂肪代謝的關(guān)系和尋求通過調(diào)控脂聯(lián)素來克服脂肪過度沉積的措施奠定理論基礎(chǔ)。

技術(shù)路線2周齡的Cobb肉雞取雞腹部脂肪，提取總RNA，克隆脂聯(lián)素基因CDS區(qū)序列真核表達載體pcDNA3.1-ADPN的構(gòu)建雞前體原代脂肪細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染前體原代脂肪細胞形態(tài)觀察試驗方法雞脂聯(lián)素基因的克隆與序列分析

Trizol法提取雞脂肪組織總RNA，根據(jù)GenBank已報道的雞脂聯(lián)素基因序列設(shè)計引物（加入組氨酸標(biāo)簽），采用反RT-PCR法擴增雞ADPN全編碼區(qū)cDNA片段。真核表達載體pcDNA3.1-ADPN的構(gòu)建1.0%瓊脂糖凝膠電泳ADPN進行膠回收并連接至pMD18-T載體，經(jīng)測序正確后，對ADPN和pcDNA3.1質(zhì)粒同時XbaI和KpnI雙酶切，膠回收ADPN目的片段和載體pcDNA3.1片段，經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，用含氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)，菌液PCR及雙酶切鑒定。

試驗方法雞前體原代脂肪細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

雞前體脂肪細胞系，含10％胎牛血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基（含100IU/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。約70%細胞貼壁融合時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前4h將培養(yǎng)基更換為Opti-MEMI優(yōu)化培養(yǎng)基。設(shè)空白對照組、空載pcDNA3.1質(zhì)粒組和pcDNA3.1-ADPN重組質(zhì)粒組。質(zhì)粒3μg、LipofectamineTM20008μL分別用Opti-MEMI稀釋至250μL室溫孵育5min，分別將pcDNA3.1或pcDNA3.1-ADPN溶液與脂質(zhì)體溶液混勻（500μL），室溫孵育20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，輕輕加入培養(yǎng)皿中。37℃、5%C02孵育6h后換為完全培養(yǎng)基。試驗方法前體原代脂肪細胞形態(tài)觀察及油紅O染色重組表達載體轉(zhuǎn)染后，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基37℃、5％C02（V/V）培養(yǎng)細胞。每兩天換一次液，三天傳一次代。顯微鏡下觀察雞前體脂肪細胞及轉(zhuǎn)染24h后細胞形態(tài)并收集細胞提取總RNA，RT-PCR檢測脂聯(lián)素及脂代謝相關(guān)基因的表達，4d后進行油紅O染色觀察細胞分化。試驗結(jié)果肉雞ADPN基因CDS區(qū)