大腸桿菌發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)總結(jié)大腸桿菌發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

首先，補(bǔ)料速率與比生長(zhǎng)速率直接影響著乙酸的生成速率和積累量（重要是補(bǔ)料速率與比生長(zhǎng)速率影響發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，進(jìn)而影響），因此適宜的控制補(bǔ)料速率和比生長(zhǎng)速率，對(duì)于控制乙酸的量有較好的效果。

另首先，必須要確保充足的溶氧，并嚴(yán)格控制pH值，并且補(bǔ)酸堿的速率盡量緩和，不能太快；溫度對(duì)于蛋白的體現(xiàn)也有很重要的影響，較低的發(fā)酵溫度下所生產(chǎn)出的蛋白大多是有活性的，而較高的發(fā)酵溫度下產(chǎn)生的蛋白大多一包涵體形式存在。

第三，選用合理的誘導(dǎo)時(shí)間非常重要，普通的誘導(dǎo)時(shí)間選在指數(shù)生長(zhǎng)后期，并且誘導(dǎo)時(shí)的比生長(zhǎng)速率最佳能控制在之內(nèi)，選在此時(shí)誘導(dǎo)，1.將菌體的快速生長(zhǎng)久與蛋白合成期分開(kāi)，使這兩個(gè)階段互不影響，有助于蛋白的高體現(xiàn)；2.已經(jīng)得到了大量的菌體，并且菌體的生物量基本靠近穩(wěn)定，不管是從動(dòng)力學(xué)角度，還是能耗，物料成本方面，都比較合理。

第四，補(bǔ)料過(guò)程中的碳氮比也很重要。若氮源過(guò)高，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累，氮源局限性，則菌體繁殖量少?gòu)亩绊懏a(chǎn)量；碳源過(guò)多，則容易刑場(chǎng)較低的pH，克制菌體生長(zhǎng)，碳源局限性，則容易引發(fā)菌體的衰老和自溶。另外，碳氮比不當(dāng)還會(huì)引發(fā)菌體按比例的吸取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而直接影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。

根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)，普通狀況下，對(duì)于一種穩(wěn)定的發(fā)酵工藝下，如果總是在固定的發(fā)酵時(shí)間段出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象，并且能排除噬菌體和染菌的可能性后，那就可能是由于碳氮比不合理造成的。能夠適宜調(diào)節(jié)碳氮比。

大家討論得較多的是有關(guān)代謝副產(chǎn)物乙酸對(duì)大腸桿菌發(fā)酵的影響，現(xiàn)總結(jié)下列幾點(diǎn)，并作出對(duì)應(yīng)解決方法。

一、代謝副產(chǎn)物-乙酸

乙酸是大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中的代謝副產(chǎn)物，在多大的濃度下產(chǎn)生克制作用多個(gè)說(shuō)法不一，普通認(rèn)為在好氣性條件下，5～10g/L的乙酸濃度就能對(duì)滯后期、最大比生長(zhǎng)速率、菌體濃度以及最后蛋白收率等都產(chǎn)生可觀察到的克制作用。當(dāng)乙酸濃度不不大于10或20g/L時(shí)，細(xì)胞將會(huì)停止生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液中乙酸濃度不不大于12g/L后外源蛋白的體現(xiàn)完全被克制。

防止乙酸產(chǎn)生的方法：

1、通過(guò)控制比生長(zhǎng)速率來(lái)減少乙酸的產(chǎn)生：

比生長(zhǎng)速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當(dāng)比生長(zhǎng)速率超出某個(gè)值時(shí)，乙酸開(kāi)始產(chǎn)生。能夠通過(guò)減少溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補(bǔ)料等辦法來(lái)減少比生長(zhǎng)速率。

2、透析培養(yǎng)：

在大腸桿菌的培養(yǎng)過(guò)程中能夠用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中的有害物質(zhì)，減少乙酸含量從而實(shí)現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的體現(xiàn)。

3、控制葡萄糖的濃度：

葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一種較低的水平上，以減少乙酸的產(chǎn)生。

慣用的控制辦法重要有：

恒pH法：大腸桿菌會(huì)代謝葡萄等產(chǎn)生乙酸，使pH值下降。因此可通過(guò)pH值的高低作為控制葡萄糖的指標(biāo)，該法的缺點(diǎn)是pH的變化不完全是由葡萄糖代謝的成果，容易造成補(bǔ)料體系出錯(cuò)。

恒溶氧法：菌體代謝時(shí)會(huì)消耗氧，使溶氧下降，當(dāng)葡萄糖濃度低到一定程度時(shí)菌體代謝下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根據(jù)溶氧曲線補(bǔ)加葡萄糖，保持溶氧恒定，能夠控制葡萄糖在一定的水平。

二、溫度

大腸桿菌發(fā)酵最適溫度是37C，當(dāng)溫度最適菌體生長(zhǎng)時(shí)，比增加速率將會(huì)增大。隨溫度上升細(xì)菌代謝加緊，其產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物也會(huì)增加。這些副產(chǎn)物會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的克制作用。菌體生長(zhǎng)過(guò)快也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。減少培養(yǎng)溫度，菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和生長(zhǎng)速率都會(huì)下降。同時(shí)也減少了有毒代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生和代謝熱的產(chǎn)生。有時(shí)減少溫度更有助于目的蛋白的對(duì)的折疊及體現(xiàn)。在重組大腸桿菌的發(fā)酵中不同發(fā)酵階段其最適溫度也不同，為了能獲得大量的目的蛋白，首先要確保菌體的量，因此在前期可優(yōu)先考慮菌體的生長(zhǎng)，到誘導(dǎo)階段應(yīng)將目的產(chǎn)物的體現(xiàn)放在首位。

三、培養(yǎng)方式

微生物的培養(yǎng)方式重要有分批、持續(xù)和補(bǔ)料分批3種。大腸桿菌發(fā)酵大多采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)，這是在當(dāng)代發(fā)酵工藝得到優(yōu)化的一種方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過(guò)程中的化學(xué)環(huán)境。使微生物處在最佳的生長(zhǎng)環(huán)境。這種方式首先能夠避免某些營(yíng)養(yǎng)成分初始濃度過(guò)高出現(xiàn)底物克制現(xiàn)象，另首先能夠避免限制性營(yíng)養(yǎng)成分被耗盡而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。補(bǔ)料分批培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)各樣的初級(jí)、次級(jí)生物產(chǎn)品和蛋白等的發(fā)酵生產(chǎn)中。

生物技術(shù)研究者追求的兩個(gè)重要目的，一是新型生物產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，另一就是為傳統(tǒng)的或新生生物產(chǎn)品，謀求更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方式。近十年來(lái)，運(yùn)用遺傳工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)某些重要的生物藥品，是生物技術(shù)領(lǐng)域中快速發(fā)展的一種重要方向。在這一研究領(lǐng)域里，如何發(fā)明更經(jīng)濟(jì)、更有效的辦法，來(lái)提高生產(chǎn)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性和產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的科學(xué)家們所關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。

運(yùn)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)重要的生物藥品，在人類(lèi)文明史上含有劃時(shí)代的意義。由于生產(chǎn)成本和生產(chǎn)率的高低直接影響公司的生存，重組生物藥品生產(chǎn)過(guò)程的優(yōu)化已經(jīng)成為一種重要問(wèn)題。它涉及下列六個(gè)方面∶(1)適宜宿主的選擇；(2)重組蛋白積累位點(diǎn)(如可溶的胞內(nèi)積累、胞內(nèi)聚合積累、周質(zhì)積累或胞外積累)的擬定；(3)重組基因最大致現(xiàn)的分子方略；(4)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)環(huán)境的優(yōu)化；(5)發(fā)酵條件的優(yōu)化；（6）后解決過(guò)程的優(yōu)化。只有這六個(gè)方面都以實(shí)現(xiàn)高生產(chǎn)率為目的，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的最優(yōu)化才干實(shí)現(xiàn)。

(一)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的優(yōu)化方略

要提高細(xì)胞密度和生產(chǎn)率，首先需要對(duì)微生物生長(zhǎng)的物理和化學(xué)環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化，涉及生長(zhǎng)培養(yǎng)基的構(gòu)成，培養(yǎng)物理參數(shù)(pH、溫度和攪拌)及產(chǎn)物誘導(dǎo)條件。優(yōu)化這些參數(shù)的目的在于確保細(xì)胞生優(yōu)點(diǎn)在最適的環(huán)境條件之下，避免營(yíng)養(yǎng)物過(guò)量或局限性、避免產(chǎn)物降解以及減少有毒產(chǎn)物的形成。

1．培養(yǎng)基構(gòu)成的優(yōu)化

培養(yǎng)基中普通含有碳(能)源、氮源，以及微營(yíng)養(yǎng)物如維生素和微量元素，這些營(yíng)養(yǎng)物的濃度與比例，對(duì)實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)重組微生物的高密度發(fā)酵是很重要的。例如，過(guò)量的Fe2+和CaCO3與相對(duì)低濃度的磷酸鹽可增進(jìn)黃曲霉生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸；鏈霉菌在60～80mmol/L-淀粉酶的產(chǎn)量可提高2倍。的產(chǎn)率明顯提高。另外還發(fā)現(xiàn)，限制精氨酸的濃度即使會(huì)克制細(xì)胞的生長(zhǎng)，但比起精氨酸充足時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)良的狀況，其重組CO32-存在下，其絲氨酸蛋白酶生產(chǎn)能力可提高10倍之多；在重組微生物達(dá)成高細(xì)胞密度后，限制磷酸鹽濃度可使抗生素和異源白介素

培養(yǎng)基中復(fù)合氮源的種類(lèi)對(duì)重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵也非常重要。普通地，當(dāng)流加培養(yǎng)基中含有酵母膏時(shí)，重組蛋白不穩(wěn)定；而當(dāng)流加培養(yǎng)基中含有蛋白胨時(shí)，大腸桿菌不能再運(yùn)用其所產(chǎn)生的乙酸。將酵母膏和蛋白胨都加入流加培養(yǎng)基中，不僅所生產(chǎn)的重組蛋白非常穩(wěn)定，細(xì)胞還能再運(yùn)用代謝合成的乙酸，這是一種非常有趣的代謝機(jī)制。

恒化技術(shù)可用于優(yōu)化精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型大腸桿菌X90的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。使該菌株以h-1的比生長(zhǎng)速率在含精氨酸的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，待培養(yǎng)達(dá)成穩(wěn)定狀態(tài)后，在恒化器內(nèi)分別加入氨基酸、維生素和微量元素來(lái)考察這些物質(zhì)對(duì)菌體生長(zhǎng)和精氨酸合成的影響。成果表明，由于氨基酸生物合成途徑的末端產(chǎn)物克制作用，加入某些氨基酸后，細(xì)胞生長(zhǎng)反而受到克制。加入NH4Cl后細(xì)胞量則出現(xiàn)了戲劇性的增加。而添加維生素對(duì)菌體生長(zhǎng)基本上沒(méi)有任何影響。通過(guò)計(jì)算生物量對(duì)每種基質(zhì)的產(chǎn)率，最后能夠擬定高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的構(gòu)成，在此優(yōu)化培養(yǎng)基上，大腸桿菌X90細(xì)胞密度可達(dá)成92g/L，同時(shí)形成56mg/L的胞外重組蛋白酶。

2．特殊營(yíng)養(yǎng)物的添加

-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中添加60在某些狀況下，向培養(yǎng)基中添加某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能提高生產(chǎn)率。這些營(yíng)養(yǎng)物的作用有可能是作為產(chǎn)物的前體，也有可能是制止產(chǎn)物的降解，例如，在培養(yǎng)重組大腸桿菌生產(chǎn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(一種由許多芳香族氨基酸構(gòu)成的蛋白)時(shí)添加苯丙氨酸，可將酶的比活力提高大概2倍；在培養(yǎng)重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)g/L的葡萄糖和100mmol/L的磷酸鉀能使重組蛋白的穩(wěn)定性明顯提高。其因素可能是由于宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多個(gè)胞外蛋白酶的活性被克制，從而避免了重組蛋白的降解。

在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加特殊物質(zhì)有時(shí)還能以一種未知的機(jī)制提高生產(chǎn)率。例如，在搖瓶培養(yǎng)Micromonosporacbersina時(shí)添加碘化鈉可使dynemicinA的產(chǎn)量提高35倍，但在小型反映器中卻無(wú)法重復(fù)這一成果。

3．限制代謝副產(chǎn)物的積累

培養(yǎng)條件的控制對(duì)代謝副產(chǎn)物的形成影響甚大。在分批或流加培養(yǎng)中，某些營(yíng)養(yǎng)物的濃度過(guò)高均會(huì)造成Crabtree效應(yīng)的產(chǎn)生。在這種效應(yīng)下，釀酒酵母會(huì)產(chǎn)生乙醇，大腸桿菌則會(huì)產(chǎn)生過(guò)量乙酸，一旦生成乙酸，細(xì)胞生長(zhǎng)及重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)受到克制。大腸桿菌形成乙酸的速度依賴(lài)于細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)基的構(gòu)成。業(yè)已確證，如果在培養(yǎng)基中添加復(fù)合營(yíng)養(yǎng)物(如大豆水解物)，則會(huì)增加乙酸的積累量。針對(duì)如何減輕由于乙酸積累而產(chǎn)生的負(fù)面影響，眾多研究者進(jìn)行了大量工作，如運(yùn)用循環(huán)發(fā)酵技術(shù)來(lái)限制乙酸在重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)中的積累。近來(lái)也有研究表明，添加某些氨基酸能減輕乙酸的克制作用。如在培養(yǎng)基中添加10-內(nèi)酰胺酶，并能刺激酶從周質(zhì)向培養(yǎng)基中釋放，但此時(shí)仍有乙酸隨著生成。-淀粉酶和mg/L的甘氨酸能明顯增進(jìn)大腸桿菌合成重組

(二)培養(yǎng)模式

由于許多營(yíng)養(yǎng)物在高濃度下對(duì)細(xì)胞有克制作用，而為了達(dá)成高細(xì)胞密度，又必須供應(yīng)大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，濃縮營(yíng)養(yǎng)物必須以與其消耗速率成比例的速度加入反映器中。為此產(chǎn)生了多個(gè)形式的補(bǔ)料方略，它能夠簡(jiǎn)樸到線性補(bǔ)料，也能夠復(fù)雜到運(yùn)用數(shù)學(xué)模型計(jì)算得出的方略來(lái)控制補(bǔ)料速率。具體來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)模式的選擇重要依賴(lài)于下列三個(gè)因素∶(1)所培養(yǎng)細(xì)胞的具體代謝行為；(2)運(yùn)用克制性底物合成目的產(chǎn)物的潛力；(3)誘導(dǎo)條件以及測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)參數(shù)的能力。

1．大腸桿菌流加發(fā)酵方略

大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清晰的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養(yǎng)時(shí)最核心的問(wèn)題是如何盡量減少乙酸的產(chǎn)生，由于高濃度葡萄糖或高比生長(zhǎng)速率帶來(lái)的高濃度乙酸會(huì)嚴(yán)重克制細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，即使葡萄糖濃度只有～g/L，大腸桿菌仍會(huì)產(chǎn)生乙酸。因此，高細(xì)胞密度發(fā)酵所采用的流加方略必須按照一定的算法制訂，以保持反映器中底物濃度處在較低的水平。營(yíng)養(yǎng)物最佳以它們的消耗速率加入反映器中，這樣不僅能夠避免底物積累到毒性水平，也不會(huì)使細(xì)胞處在饑餓狀態(tài)。

近年來(lái)已經(jīng)報(bào)道了多個(gè)控制大腸桿菌流加培養(yǎng)中流加速率的辦法，其中大多數(shù)是將流加速率與一種物理參數(shù)間接耦合(如溶氧、pH或CO2釋放速率)。有學(xué)者將溶氧控制在一種預(yù)定值上以確保較低的生長(zhǎng)速率，成果乙酸產(chǎn)生極少，最后細(xì)胞干重達(dá)成110g/L，并發(fā)現(xiàn)較低的比生長(zhǎng)速率尚有助于重組蛋白的高體現(xiàn)。在另一種控制低比生長(zhǎng)速率的高細(xì)胞密度培養(yǎng)中，研究者采用先指數(shù)流加葡萄糖、銨鹽和無(wú)機(jī)鹽，后采用廣義線性流加的培養(yǎng)方略，有效地避免了乙酸的積累，重組大腸桿菌的細(xì)胞密度達(dá)成66g/L，通過(guò)溫度誘導(dǎo)可在胞內(nèi)形成g/L的活性重組蛋白。

如果將葡萄糖濃度控制在一種不致于產(chǎn)生毒性的足夠低的水平上，也能夠使細(xì)胞在不存在限制性基質(zhì)的狀況下快速生長(zhǎng)到高細(xì)胞密度。這種控制方略對(duì)儀器的規(guī)定較高。Kleman等采用在線葡萄糖分析儀，以微生物對(duì)葡萄糖的需求來(lái)決定葡萄糖和其它營(yíng)養(yǎng)物的流加速率，這一算法能夠在產(chǎn)物誘導(dǎo)階段中根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的變化自動(dòng)調(diào)節(jié)流加速率。培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌MV1190，其質(zhì)粒中帶有編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最后細(xì)胞干重達(dá)成39g/L，產(chǎn)生g/L可溶的活性蛋白。

2．重組酵母的流加發(fā)酵

酵母中廣泛用于遺傳工程研究的菌株是釀酒酵母。但采用釀酒酵母作為重組宿主也有下列缺點(diǎn)∶(1)重組蛋白生產(chǎn)的水平較低；(2)質(zhì)粒不穩(wěn)定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不但愿出現(xiàn)的，由于這會(huì)克制重組蛋白的形成。近來(lái)研究表明，其它酵母，如巴斯德畢赤氏酵母也含有作為重組宿主的潛力。Clare等比較了重組巴斯德畢赤氏酵母和釀酒酵母在高細(xì)胞密度狀態(tài)下體現(xiàn)和分泌鼠表皮生長(zhǎng)因子的能力。培養(yǎng)每基因組含有19個(gè)拷貝數(shù)的巴斯德畢赤氏酵母，最后可獲得447mg/L胞內(nèi)重組蛋白；而培養(yǎng)釀酒酵母所獲得的最高水平僅6～7mg/L。

通過(guò)先指數(shù)流加，后采用基于CO2釋放和RQ值的線性流加控制方式可使重組巴斯德畢赤氏酵母的細(xì)胞干重達(dá)成80～90g/L，并分泌高水平的重組人血清蛋白。而培養(yǎng)釀酒酵母，細(xì)胞干重和重組蛋白的產(chǎn)量?jī)H分別為25g/L和20mg/L。即使將釀酒酵母的生長(zhǎng)速率維持在～h-1，也將形成10～13g/L的乙醇，因而造成產(chǎn)率減少。但釀酒酵母產(chǎn)乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一種復(fù)雜的流加系統(tǒng)，將酵母的生長(zhǎng)速率控制在h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生產(chǎn)最大而乙醇的生成最小。

3．流加培養(yǎng)的控制

一種好的流加控制系統(tǒng)必須避免兩種傾向∶一是流加過(guò)量，補(bǔ)料組分在反映器中積累從而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成產(chǎn)生克制；二是流加局限性，這可能會(huì)造成細(xì)胞必需營(yíng)養(yǎng)物的缺少。計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，為流加培養(yǎng)的控制提供了更有效的手段。近年來(lái)，應(yīng)用計(jì)算機(jī)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)和控制發(fā)酵過(guò)程的研究屢見(jiàn)報(bào)道。由于當(dāng)代計(jì)算機(jī)技術(shù)的協(xié)助，人們能夠采用多個(gè)生長(zhǎng)參數(shù)和數(shù)學(xué)模型來(lái)控制流加培養(yǎng)中營(yíng)養(yǎng)物的添加，從而使復(fù)雜的控制系統(tǒng)得以實(shí)現(xiàn)。在多個(gè)人工智能技術(shù)中，含糊推理(fuzzyreasoning)是應(yīng)用最廣的一種。含糊邏輯控制(fuzzylogiccontrol)部分依賴(lài)于數(shù)學(xué)生長(zhǎng)模型，也采用“語(yǔ)言定義的規(guī)則系統(tǒng)”(linguisticallydefinedrulessystem)來(lái)協(xié)助系統(tǒng)響應(yīng)發(fā)酵過(guò)程的非線性和動(dòng)態(tài)行為。Alfafara等在流加培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的研究中，采用一種含糊邏輯控制系統(tǒng)來(lái)控制葡萄糖的流加速度，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化后谷胱甘肽的比產(chǎn)生速率達(dá)成h-1?，F(xiàn)在，在流加培養(yǎng)中應(yīng)用含糊邏輯控制技術(shù)的最大問(wèn)題在于如何減少底物和產(chǎn)物濃度振蕩所需的調(diào)節(jié)次數(shù)。自適應(yīng)含糊邏輯控制算法的發(fā)展可望對(duì)此有所協(xié)助。

(三)誘導(dǎo)方略

對(duì)于許多帶有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組微生物，只有將生長(zhǎng)久和產(chǎn)物形成期分開(kāi)才干獲得最大生產(chǎn)率。在流加培養(yǎng)中，這兩段時(shí)期的分離能夠通過(guò)延遲誘導(dǎo)直至細(xì)胞生長(zhǎng)已達(dá)成高密度來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，如果質(zhì)粒穩(wěn)定并且產(chǎn)物對(duì)培養(yǎng)物無(wú)毒，那么能夠用重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)提高生產(chǎn)率。有學(xué)者采用重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)釀酒酵母，每24h更換50%的培養(yǎng)基，持續(xù)30d，其產(chǎn)物(hirudin)的產(chǎn)量可比持續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)提高3倍。

-內(nèi)酰胺酶的重組大腸桿菌，將第一罐的發(fā)酵液導(dǎo)入第二罐中，構(gòu)成一種兩級(jí)培養(yǎng)系統(tǒng)。第二罐中添加營(yíng)養(yǎng)物以及IPTG作為誘導(dǎo)物。成果獲得300如果誘導(dǎo)物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞都有毒性，那么應(yīng)當(dāng)人為地將誘導(dǎo)期和生長(zhǎng)久分開(kāi)。對(duì)于這種狀況，兩級(jí)持續(xù)培養(yǎng)是最適宜的培養(yǎng)方式。控制第一罐的條件，使細(xì)胞生優(yōu)點(diǎn)在最適狀態(tài)之下，而誘導(dǎo)與產(chǎn)物形成則發(fā)生在第二罐中。例如，在恒化器中培養(yǎng)一株能產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶(相稱(chēng)于總蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。這一系統(tǒng)最少能夠穩(wěn)定運(yùn)行50mg活性d。另一相似的系統(tǒng)被用于培養(yǎng)大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白A-EcoRI蛋白融合體。培養(yǎng)在恒濁器中進(jìn)行，對(duì)第二罐進(jìn)行熱誘導(dǎo)，成果獲得了比分批發(fā)酵高6倍的比生產(chǎn)率。研究者還嘗試將生產(chǎn)重組蛋白的兩級(jí)持續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)與親和色譜柱相組合，試圖實(shí)現(xiàn)重組蛋白生產(chǎn)和純化的持續(xù)化。但由于技術(shù)上的某些因素，這種組合尚未得到成功。

比生長(zhǎng)速率對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成都有重要作用。經(jīng)常會(huì)碰到的狀況是，最適于細(xì)胞生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率卻并不適于產(chǎn)物的形成或其它特性的實(shí)現(xiàn)。我們?cè)谂囵B(yǎng)面包酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)，比生長(zhǎng)速率為h-1時(shí)細(xì)胞產(chǎn)率最高，而比生長(zhǎng)速率為h-1時(shí)酵母發(fā)酵活力最佳。針對(duì)這一現(xiàn)象我們提出了一種兩階段控制比生長(zhǎng)速率的流加培養(yǎng)方略，成果在一種反映器中實(shí)現(xiàn)了高發(fā)酵活力與高細(xì)胞產(chǎn)率的統(tǒng)一。(四)細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵從反映器角度來(lái)考慮獲得高細(xì)胞密度，普通采用的是細(xì)胞循環(huán)生物反映器。這種反映器運(yùn)用一種切向流或中空纖維過(guò)濾器從醪液中分離細(xì)胞，細(xì)胞返回容器，無(wú)細(xì)胞醪液則以給定速率持續(xù)轉(zhuǎn)移，同時(shí)代之以新鮮培養(yǎng)基。運(yùn)用細(xì)胞循環(huán)技術(shù)，可使細(xì)胞保存在反映器中并達(dá)成高細(xì)胞密度，而毒性廢產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物則不停轉(zhuǎn)移，這能夠延遲或避免由細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)物形成引發(fā)的反饋克制。細(xì)胞循環(huán)生物反映器能夠合用于多個(gè)機(jī)體和生產(chǎn)系統(tǒng)，但它的應(yīng)用也存在許多限制，重要涉及∶(1)作用于進(jìn)入過(guò)濾單元的細(xì)胞的剪應(yīng)力太大；(2)系統(tǒng)的放大存在許多實(shí)際困難。

操作細(xì)胞循環(huán)生物反映器時(shí)必須考慮兩個(gè)因素，一是稀釋率(流速／體積)；二是循環(huán)速率(指通過(guò)過(guò)濾系統(tǒng)的培養(yǎng)基速率)。稀釋率的大小影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)稀釋率的規(guī)定也不同；高的循環(huán)速率可使組分混合均勻，特別合用于細(xì)胞容易凝聚或成團(tuán)的狀況。但循環(huán)速率過(guò)高會(huì)使作用在細(xì)胞上的剪切力過(guò)高，也會(huì)造成過(guò)濾單元膜的快速損壞。因此，很難同時(shí)擬定適宜的稀釋率與循環(huán)速率，這也是限制細(xì)胞循環(huán)技術(shù)應(yīng)用的一種重要因素。

細(xì)胞循環(huán)技術(shù)可望獲得高的體積生產(chǎn)率，這對(duì)產(chǎn)物的提取非常有利。近年來(lái)循環(huán)發(fā)酵技術(shù)已廣泛用于生產(chǎn)細(xì)胞代謝物，如燃料酒精和有機(jī)酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵技術(shù)，重組大腸桿菌細(xì)胞干重達(dá)成145g/L，其重組青霉素?；干a(chǎn)率比分批培養(yǎng)提高了近10倍。對(duì)于活細(xì)胞即為所但愿的產(chǎn)物的培養(yǎng)，細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵也能發(fā)揮作用。如在食品工業(yè)中，為生產(chǎn)牛奶，奶酪和酸乳酪需培養(yǎng)不同的乳桿菌，采用細(xì)胞循環(huán)生物反映器能夠很容易地提高這些生物體的的密度。

在多個(gè)控制手段的協(xié)助下，現(xiàn)在人們已經(jīng)能很容易地獲得超出100g/L的細(xì)胞密度。但已有的研究成果表明，與最適生物量形成所對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)條件普通會(huì)造成較低的比生產(chǎn)率。例如，用細(xì)胞循環(huán)反映器生產(chǎn)2,3-丁二醇，生物量提高了大概6倍，但體積生產(chǎn)率只提高了2～3倍。同樣，流加培養(yǎng)能夠使鏈霉菌的細(xì)胞干重達(dá)成43g/L，但蛋白酶活為零，而當(dāng)細(xì)胞干重為18g/L時(shí)蛋白酶活卻高達(dá)3500U/mL。我們?cè)谘芯恐幸步?jīng)常碰到類(lèi)似問(wèn)題。要解決這一問(wèn)題，首先應(yīng)當(dāng)研究如何增進(jìn)重組蛋白的高效體現(xiàn)和提高重組菌株的穩(wěn)定性，另首先要研究與高細(xì)胞密度有關(guān)聯(lián)的高水平產(chǎn)物的形成條件。

引言：高密度培養(yǎng)技術(shù)(High—cell—densitycultivation，HCDC)，也就是高密度發(fā)酵技術(shù)，提高菌體的發(fā)酵密度，最后提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)不僅能夠減少培養(yǎng)體積、強(qiáng)化下游分離提取，還能夠縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資從而減少生產(chǎn)成本，能極大地提高產(chǎn)品在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。這一目的的實(shí)現(xiàn)，除了重組菌本身的體現(xiàn)性質(zhì)外，還必須賦予重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物體現(xiàn)的最適環(huán)境條件，涉及適宜的培養(yǎng)基構(gòu)成、適宜的培養(yǎng)溫度、pH、穩(wěn)定的比生長(zhǎng)速率、適宜的溶解氧以及營(yíng)養(yǎng)物的合理流加等。重組大腸桿菌高密度發(fā)酵成功的核心技術(shù)是補(bǔ)料方略，也就是根據(jù)重組菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)及產(chǎn)物的體現(xiàn)方式采用合理的營(yíng)養(yǎng)物流加方式。碳源和氮源是兩種慣用的限制性基質(zhì)，葡萄糖因細(xì)菌運(yùn)用快且價(jià)廉易得，已廣泛用作重組菌高密度發(fā)酵的限制性基質(zhì)。大腸桿菌在過(guò)量葡萄糖或缺氧的條件下會(huì)發(fā)生“葡萄糖效應(yīng)”，積累大量有機(jī)酸而影響重組菌的生長(zhǎng)和外源蛋白的有效體現(xiàn)。因此大腸桿菌高密度發(fā)酵中，合理流加碳源使葡萄糖效應(yīng)減少，是成功的核心。

首先對(duì)重組Escherichiacoli的高密度培養(yǎng)一文進(jìn)行重點(diǎn)推薦[url]*****:

該文從高密度培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基成分及作用、高密度培養(yǎng)的過(guò)程控制參數(shù)、底物補(bǔ)料方式的種類(lèi)及特點(diǎn)對(duì)重組Escherichiacoli高密度培養(yǎng)進(jìn)行了概述；并敘述了乙酸的生成機(jī)制和控制乙酸生成的方略；最后對(duì)重組Escherichiacoli高密度培養(yǎng)及外源蛋白高體現(xiàn)進(jìn)行了研究。知識(shí)點(diǎn)全，敘述細(xì)致全方面，不愧為大腸桿菌培養(yǎng)者和學(xué)習(xí)者的不錯(cuò)選擇，版主在此進(jìn)行重點(diǎn)推薦

另首先有諸多會(huì)員對(duì)培養(yǎng)的有關(guān)問(wèn)題進(jìn)行了討論，具體討論話題及內(nèi)容總結(jié)以下：

問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)大腸桿菌發(fā)酵中C:N怎么來(lái)控制啊

答：如果是在分批補(bǔ)料發(fā)酵中C含量控制在，N含量控制在，經(jīng)驗(yàn)之談

問(wèn)：請(qǐng)教大腸桿菌搖瓶發(fā)酵用的化學(xué)合成培養(yǎng)基都有哪些

答：LB，SOB，SOC等，具體能夠查閱分子克隆！

討論1：大腸桿菌與否能運(yùn)用乙酸作為碳源的問(wèn)題討論

問(wèn)題：發(fā)酵過(guò)程中大腸桿菌在葡萄糖等碳源消耗完的狀況下，能否運(yùn)用其代謝產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物乙酸作為碳源

回答1：不能啊，乙酸又不能進(jìn)入TCA循環(huán)

回答2：大腸桿菌就怕產(chǎn)生乙酸影響代謝。

回答3：能運(yùn)用其代謝產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物乙酸作為碳源，沒(méi)有問(wèn)題的。不懂得樓上兩位怎么會(huì)說(shuō)不能運(yùn)用。但是過(guò)高的乙酸對(duì)菌體生長(zhǎng)不利

回答4：乙酸是大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中的代謝副產(chǎn)物，在多大的濃度下產(chǎn)生克制作用多個(gè)說(shuō)法不一，普通認(rèn)為在好氣性條件下，5～10g/L的乙酸濃度就能對(duì)滯后期、最大比生長(zhǎng)速率、菌體濃度以及最后蛋白收率等都產(chǎn)生可觀察到的克制作用。當(dāng)乙酸濃度不不大于10或20g/L時(shí)，細(xì)胞將會(huì)停止生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液中乙酸濃度不不大于12g/L后外源蛋白的體現(xiàn)完全被克制。

看到過(guò)以乙酸作碳源進(jìn)行大腸桿菌發(fā)酵的，但不是高密度發(fā)酵，且直接以乙酸作碳源（不加入任何其它碳源），而不是以代謝產(chǎn)生的乙酸為碳源。乙酸是不能直接進(jìn)入TCA循環(huán)的，必須是被氧化后才干被運(yùn)用。3樓的說(shuō)能夠運(yùn)用其代謝副產(chǎn)物乙酸作為碳源，我也愿聽(tīng)其詳，望不吝賜教！

除TCA循環(huán)外，還牽涉到乙醛酸途徑和磷酸戊糖途徑。但普通的大腸桿菌都是進(jìn)行TCA循環(huán)，除了某些特殊菌種如lpdA基因敲除突變E．coli當(dāng)TCA循環(huán)被克制就會(huì)進(jìn)行乙醛酸途徑和磷酸戊糖途徑。

回答5：我做的是大腸桿菌的基因工程菌，就是不能運(yùn)用乙酸，要避免乙酸的產(chǎn)生，對(duì)于整個(gè)代謝有很大影響。

回答6：這個(gè)問(wèn)題呢大腸桿菌絕對(duì)是能夠運(yùn)用乙酸的。由于我做的就是有關(guān)大腸桿菌產(chǎn)乙酸的課題。當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，大腸桿菌回產(chǎn)生乙酸。而當(dāng)葡萄糖被消耗光后來(lái)，大腸桿菌就能夠運(yùn)用乙酸來(lái)提供能量。這一點(diǎn)是必定的

我在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還同時(shí)補(bǔ)加乙酸和葡萄糖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表面是能夠運(yùn)用乙酸的。

但是由于乙酸的能夠影響大腸桿菌的生長(zhǎng)和外源基因的體現(xiàn)，因此在以葡萄糖為碳源時(shí)，都采用限制流加方式來(lái)補(bǔ)料。

但事實(shí)上大腸桿菌是能夠運(yùn)用乙酸的。

回答7：具體的運(yùn)用途徑是乙酸首選被轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，然后能夠進(jìn)入TCA循環(huán)，同時(shí)也能夠運(yùn)用糖異生途徑來(lái)和成其它氨基酸的前體。具體的途徑能夠查一下NCBI上面的文獻(xiàn)。

回答8：能夠吧，沒(méi)有碳源的狀況下，適量的乙酸應(yīng)當(dāng)還能夠有助于生長(zhǎng)的，因此發(fā)酵中，誘導(dǎo)前能夠空耗一段時(shí)間。

討論2：做大腸桿菌的高密度發(fā)酵時(shí)，以甘油作為碳源進(jìn)行補(bǔ)料流加存在什么問(wèn)題

問(wèn)題：普通以甘油作為碳源進(jìn)行大腸桿菌的高密度發(fā)酵產(chǎn)生乙酸量少，比較容易獲得高密度。除了生長(zhǎng)速率較慢、菌體收率低，及甘油成本較之葡萄糖高之外，尚有什么缺點(diǎn)嗎但愿做過(guò)這方面研究或有這方面知識(shí)的朋友進(jìn)來(lái)一起討論。

回答1：做基因工程菌發(fā)酵，我們采用的是葡萄糖做為唯一的碳源，進(jìn)行流加補(bǔ)料，如果采用甘油相對(duì)比較好，能夠減少高密度發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生的乙酸。

甘油脫水酶不僅對(duì)氧敏感而容易失活,并且在有甘油存在時(shí),它也會(huì)發(fā)生自殺失活，過(guò)高的甘油濃度會(huì)增加3.磷酸甘油(Ｇ3Ｐ)的積聚從而明顯克制菌體的生長(zhǎng)，由于甘油濃度過(guò)低也不利于基因的轉(zhuǎn)移形成。在采用甘油作為碳源，同時(shí)補(bǔ)加適量的葡萄糖作為菌體生長(zhǎng)的優(yōu)先碳源,以提高甘油的轉(zhuǎn)化率。我們現(xiàn)在采用葡萄糖作為碳源，下步計(jì)劃做加入適量甘油來(lái)減少乙酸產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)。

回答2：高密度發(fā)酵當(dāng)中，補(bǔ)料還得注意攪拌轉(zhuǎn)速的問(wèn)題。不同濃度底物流加對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速是不同，我遇過(guò)這樣的問(wèn)題。討論3：影響重組大腸桿菌發(fā)酵的重要因素有哪些問(wèn)題：大家討論得較多的是有關(guān)代謝副產(chǎn)物乙酸對(duì)大腸桿菌發(fā)酵的影響，針對(duì)我們論壇所發(fā)的帖，我先總結(jié)下列幾點(diǎn)，并作出對(duì)應(yīng)解決方法。

回答1：一、代謝副產(chǎn)物-乙酸

乙酸是大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中的代謝副產(chǎn)物，在多大的濃度下產(chǎn)生克制作用多個(gè)說(shuō)法不一，普通認(rèn)為在好氣性條件下，5～10g/L的乙酸濃度就能對(duì)滯后期、最大比生長(zhǎng)速率、菌體濃度以及最后蛋白收率等都產(chǎn)生可觀察到的克制作用。當(dāng)乙酸濃度不不大于10或20g/L時(shí)，細(xì)胞將會(huì)停止生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液中乙酸濃度不不大于12g/L后外源蛋白的體現(xiàn)完全被克制。

防止乙酸產(chǎn)生的方法：

1、通過(guò)控制比生長(zhǎng)速率來(lái)減少乙酸的產(chǎn)生：

比生長(zhǎng)速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當(dāng)比生長(zhǎng)速率超出某個(gè)值時(shí)，乙酸開(kāi)始產(chǎn)生。能夠通過(guò)減少溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補(bǔ)料等辦法來(lái)減少比生長(zhǎng)速率。

2、透析培養(yǎng)：

在大腸桿菌的培養(yǎng)過(guò)程中能夠用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中的有害物質(zhì)，減少乙酸含量從而實(shí)現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的體現(xiàn)。

3、控制葡萄糖的濃度：

葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一種較低的水平上，以減少乙酸的產(chǎn)生。

慣用的控制辦法重要有：

恒pH法：大腸桿菌會(huì)代謝葡萄等產(chǎn)生乙酸，使pH值下降。因此可通過(guò)pH值的高低作為控制葡萄糖的指標(biāo)，該法的缺點(diǎn)是pH的變化不完全是由葡萄糖代謝的成果，容易造成補(bǔ)料體系出錯(cuò)。

恒溶氧法：菌體代謝時(shí)會(huì)消耗氧，使溶氧下降，當(dāng)葡萄糖濃度低到一定程度時(shí)菌體代謝下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根據(jù)溶氧曲線補(bǔ)加葡萄糖，保持溶氧恒定，能夠控制葡萄糖在一定的水平。

二、溫度

大腸桿菌發(fā)酵最適溫度是37C，當(dāng)溫度最適菌體生長(zhǎng)時(shí)，比增加速率將會(huì)增大。隨溫度上升細(xì)菌代謝加緊，其產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物也會(huì)增加。這些副產(chǎn)物會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的克制作用。菌體生長(zhǎng)過(guò)快也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。減少培養(yǎng)溫度，菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和生長(zhǎng)速率都會(huì)下降。同時(shí)也減少了有毒代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生和代謝熱的產(chǎn)生。有時(shí)減少溫度更有助于目的蛋白的對(duì)的折疊及體現(xiàn)。在重組大腸桿菌的發(fā)酵中不同發(fā)酵階段其最適溫度也不同，為了能獲得大量的目的蛋白，首先要確保菌體的量，因此在前期可優(yōu)先考慮菌體的生長(zhǎng)，到誘導(dǎo)階段應(yīng)將目的產(chǎn)物的體現(xiàn)放在首位。

三、培養(yǎng)方式

微生物的培養(yǎng)方式重要有分批、持續(xù)和補(bǔ)料分批3種。大腸桿菌發(fā)酵大多采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)，這是在當(dāng)代發(fā)酵工藝得到優(yōu)化的一種方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過(guò)程中的化學(xué)環(huán)境。使微生物處在最佳的生長(zhǎng)環(huán)境。這種方式首先能夠避免某些營(yíng)養(yǎng)成分初始濃度過(guò)高出現(xiàn)底物克制現(xiàn)象，另首先能夠避免限制性營(yíng)養(yǎng)成分被耗盡而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。補(bǔ)料分批培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)各樣的初級(jí)、次級(jí)生物產(chǎn)品和蛋白等的發(fā)酵生產(chǎn)中。

回答2：基因工程菌最重要的是

1、前期要里積累到一定的數(shù)量；

2、數(shù)量達(dá)成之后，要快速進(jìn)行誘導(dǎo)；

3、升溫之后，要保持一定的補(bǔ)料速率，控制乙酸的積累量，使DNA體現(xiàn)達(dá)成最大。

回答3：克制本底體現(xiàn)至關(guān)重要！?。?/p>

由于是重組大腸，外源基因的體現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)是有很大影響的，換句話說(shuō)是有毒性的，只是毒性大小的問(wèn)題，超出了承受范疇成果可想而知，因此如何在添加誘導(dǎo)物前克制本地體現(xiàn)非常重要！

解決辦法：優(yōu)化培養(yǎng)基，碳源的運(yùn)用：葡萄糖>乳糖,故能夠調(diào)節(jié)兩者的比例實(shí)現(xiàn)本地體現(xiàn)的最小化.等到大腸長(zhǎng)到含有抵抗力的成熟期就ok了,注意葡萄糖不要多否則背面的IPTG無(wú)法起到誘導(dǎo)的作用了!討論4：高密度發(fā)酵是不是都能實(shí)現(xiàn)

問(wèn)題：現(xiàn)在心中存在一種疑問(wèn)：是不是大部分基因工程菌（大腸桿菌或者酵母），都能實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵嗎

或者上發(fā)酵罐的產(chǎn)量都能比搖瓶水平高嗎高多少才算正常呢我據(jù)說(shuō)一種說(shuō)法：說(shuō)普通發(fā)酵罐條件優(yōu)化了，都會(huì)比搖瓶高50%以上，是真的嗎

回答1：現(xiàn)階段手上有一種菌種，真是嘗試了多個(gè)各樣的碳源，不同種類(lèi)的氮源，它的酶活水平就是很穩(wěn)定，在發(fā)酵罐上也調(diào)節(jié)了溶氧，控制pH，酶活最多只有20%的提高。真是很是郁悶，沒(méi)有太好的思路

回答2：普通的講，只要該微生物能高密度生長(zhǎng)，則該基因工程菌就能夠高密度發(fā)酵（除非構(gòu)建的產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)都毒害作用，這個(gè)狀況極少，由于不會(huì)選擇這種宿主菌）

至于大罐優(yōu)化發(fā)酵的成果，普通都能提高產(chǎn)量或效價(jià)的，由于普通大罐的生長(zhǎng)環(huán)境比搖瓶要好控制的多。但是成果區(qū)別很大，有的大罐發(fā)酵能夠比搖瓶提高10倍，幾十倍的。

回答3：細(xì)胞密度發(fā)酵所采用的流加方略必須按照一定的算法制訂，以保持反映器中底物濃度處在較低的水平。營(yíng)養(yǎng)物最佳以它們的消耗速率加入反映器中，這樣不僅能夠避免底物積累到毒性水平，也不會(huì)使細(xì)胞處在饑餓狀態(tài)。

重組Escherichiacoli的高密度培養(yǎng)及其過(guò)程控制參數(shù)

由于Escherichiacoli高密度培養(yǎng)能夠提高單位體積的產(chǎn)量，利于下游的分離純化。因此，Escherichiacoli高密度培養(yǎng)是發(fā)酵生產(chǎn)追求的目的。現(xiàn)在，采用透析反映器培養(yǎng)K-12以及培養(yǎng)重組Escherichiacoli生產(chǎn)PHB菌體濃度達(dá)成LDCW。已發(fā)表的Escherichiacoli最高菌濃為(DCW)/L。限制Escherichiacoli高密度發(fā)酵重要是營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)限制（涉及溶氧供應(yīng)局限性），代謝副產(chǎn)物積累和發(fā)酵液流變學(xué)特性等因素的限制。

高密度培養(yǎng)過(guò)程需要控制參數(shù)：

溶氧

在微生物培養(yǎng)時(shí)，必須不停地向培養(yǎng)液提供足夠的氧，以滿足微生物生長(zhǎng)代謝的需要。在實(shí)驗(yàn)室中，能夠通過(guò)搖床的往復(fù)運(yùn)動(dòng)或偏心旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)對(duì)搖瓶中的微生物供氧，而較大生產(chǎn)規(guī)模的培養(yǎng)裝置則需采用無(wú)菌空氣并同時(shí)進(jìn)行攪拌的方式對(duì)微生物供氧，通風(fēng)和攪拌的目的就是提供微生物生長(zhǎng)和代謝所需的氧。由于微生物的新陳代謝與氧氣呼吸有關(guān)，調(diào)節(jié)通氣和攪拌可影響發(fā)酵周期時(shí)間的長(zhǎng)短和代謝產(chǎn)物生成的高低，因而發(fā)酵液中的溶氧濃度是發(fā)酵過(guò)程中的一種需要調(diào)節(jié)控制的重要參數(shù)，在培養(yǎng)過(guò)程中有效而經(jīng)濟(jì)的供氧是極為重要的。工藝上重要的控制溶氧手段有下列幾個(gè)：1)變化通氣速率(增大通風(fēng)量)；(2)變化攪拌速度；(3)變化氣體構(gòu)成中的氧分壓；(4)變化罐壓；(5)變化發(fā)酵液的理化性質(zhì)；（6）加入氧載體。

溫度

由于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成代謝都是在多個(gè)酶的催化下進(jìn)行的，而溫度卻是確保酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵過(guò)程中必須確保穩(wěn)定而適宜的溫度環(huán)境。溫度對(duì)發(fā)酵的影響是多方面的，對(duì)微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成、代謝的影響是由多個(gè)因素綜合體現(xiàn)的成果。

pH值

發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，是發(fā)酵過(guò)程中重要參數(shù)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的積累有很大的影響。對(duì)于同一種微生物，由于pH值的不同，形成的發(fā)酵產(chǎn)物也會(huì)不同。發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化狀況1)在微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)階段，由于所用的微生物菌種不同，相對(duì)于接種后的起始pH值來(lái)說(shuō)，發(fā)酵液的pH值有上升或下降的趨勢(shì)；(2)在生產(chǎn)階段，普通發(fā)酵液的pH值趨于穩(wěn)定，維持在最適合產(chǎn)物形成的pH范疇；(3)在微生物細(xì)胞的自溶階段，隨著培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的積累和活躍，微生物趨于自溶，引發(fā)培養(yǎng)液中氨基酸等的增加，致使pH值上升。引發(fā)發(fā)酵液的pH值下降的重要因素有

1)培養(yǎng)基中的碳/氮比不適宜，碳源過(guò)多，特別是葡萄糖過(guò)量或者中間補(bǔ)糖過(guò)多或溶解氧局限性，致使糖等物質(zhì)的氧化不完全，培養(yǎng)液中有機(jī)酸會(huì)大量積累；(2)消泡油加得過(guò)多；(3)微生物生理酸性物質(zhì)的存在。引發(fā)發(fā)酵液pH值上升的重要因素有1)培養(yǎng)基中的碳/氮比不當(dāng)，氮源過(guò)多，氨基酸釋放會(huì)使pH值上升；(2)生理堿性物質(zhì)的存在；(3)中間補(bǔ)料液中氨水或尿素等堿性物質(zhì)加入過(guò)多。

重組Escherichiacoli高密度培養(yǎng)及外源蛋白高體現(xiàn)研究

重組Escherichiacoli的高密度培養(yǎng)的目的在于獲得更高的目的蛋白單位體積產(chǎn)量。但是在重組Escherichiacoli的高密度培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)常遇見(jiàn)的是高密度低體現(xiàn)現(xiàn)象，體現(xiàn)效率只有搖瓶的三分之一。實(shí)現(xiàn)外源蛋白在菌體高密度培養(yǎng)過(guò)程中高效率體現(xiàn)仍是工程重組菌發(fā)酵的研究熱點(diǎn)。

高密度培養(yǎng)下提高外源基因體現(xiàn)的方略

(1)添加復(fù)合氮源

菌體生長(zhǎng)至高密度時(shí)，營(yíng)養(yǎng)成分逐步耗盡。營(yíng)養(yǎng)的缺少也是限制高密度培養(yǎng)下實(shí)現(xiàn)高體現(xiàn)的因素。Shimizu等發(fā)現(xiàn)在體現(xiàn)階段，限制蛋白胨和酵母抽提物的濃度，對(duì)外源基因體現(xiàn)不利，補(bǔ)料液中加大酵母抽提物比例能夠提高外源蛋白的體現(xiàn)量。認(rèn)為有機(jī)氮源提供豐富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、維生素、生物素以及某些生物活性物質(zhì)，減輕了細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)，增進(jìn)了外源蛋白的體現(xiàn)。

(2)運(yùn)用代謝工程辦法消除乙酸的克制作用

乙酸對(duì)菌體生長(zhǎng)和外源蛋白體現(xiàn)克制的機(jī)理普通認(rèn)為是乙酸破壞了跨膜質(zhì)子梯度，而跨膜質(zhì)子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜運(yùn)輸所必需。pH為中性時(shí)乙酸以HAc和Ac－形式共存，Hac滲入過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)（pH約為）再分解為H＋和Ac－。由于不停滲入使胞外HAc和Ac－之間平衡向Hac移動(dòng)，成果引發(fā)一種凈電中性H＋內(nèi)流，減少了胞內(nèi)pH。由于含有緩沖功效的培養(yǎng)基體積大，乙酸滲入不會(huì)造成胞外pH發(fā)生激烈變化，因此胞內(nèi)pH減少將產(chǎn)生去偶聯(lián)影響。細(xì)胞本身的穩(wěn)態(tài)機(jī)制需要能量以變化胞內(nèi)pH減少趨勢(shì)，即使質(zhì)