醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)報(bào)告實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：利用聚乙二醇（簡(jiǎn)稱PEG）為介導(dǎo)物進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞融合（cellfusion）是指兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞通過質(zhì)膜融合形成單個(gè)雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合，結(jié)果產(chǎn)生雜交細(xì)胞（hybrid）親本相同的融合細(xì)胞稱為同核體，反之稱為異核體。細(xì)胞的融合是利用了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，在外界誘導(dǎo)作用下（常用的有滅活的仙臺(tái)病毒、PEG、電刺激等）各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處脂膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，使細(xì)胞發(fā)生融合。所以本次實(shí)驗(yàn)利用聚乙二醇的此性質(zhì)，改變蟾蜍的血細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行細(xì)胞融合。本次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所用蟾蜍的血細(xì)胞，其原因有：1、蟾蜍血便宜，是單個(gè)散在性的細(xì)胞，不需要解離。2、蟾蜍血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行鑒定。如果經(jīng)過融合的細(xì)胞經(jīng)鏡檢觀察仍然只有一個(gè)細(xì)胞核那么即為未融合，如果經(jīng)過融合的細(xì)胞經(jīng)鏡檢觀察有兩個(gè)或者兩個(gè)以上的細(xì)胞核即為融合成功了的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟：1、先將蟾蜍處死取蟾蜍血2ml和2mlAlsver液混合后，再加上6mlAlsver混勻后制懸液。（可在4℃下保存2、取①溶液1ml加上4ml0.85%的NaCl溶液進(jìn)行一下兩次離心處理。=1\*GB3①1200r/min離心5min(去上清液再加入5ml的0.85%NaCl溶液=2\*GB3②1000-1200r/min離心5min3、將上步最后一次的沉降雪球（去上清液后，約0.1-0.2ml）,加入GKN液，至1-2ml使之成10%的細(xì)胞懸液）4、取上述10%的血球懸液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000萬個(gè)，即15×107個(gè)/ml5、取步驟4中所得懸液1ml+0.5ml的PEG液，均勻滴片，在常溫下2-3min后即可鏡下觀察。預(yù)期結(jié)果：在高倍鏡下可以看到兩個(gè)或兩個(gè)以上的蟾蜍血紅細(xì)胞融合在一起。教師：日期：實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備、器具表名稱規(guī)格、型號(hào)數(shù)量說明顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡1臺(tái)用于鏡檢離心機(jī)普通離心機(jī)1臺(tái)用于提取血細(xì)胞水浴箱恒溫水浴箱1臺(tái)用于恒溫水浴加熱離心管50ml2支用于提取血細(xì)胞滴管膠頭1支用于粗略取用液體載玻片2.5cm*7.5cm1張用于制作涂片蓋玻片2cm*2cm1張用于制作涂片實(shí)驗(yàn)試劑表名稱規(guī)格用量說明Alsver液葡萄糖2.05g檸檬酸鈉0.80g,Nacl0.42g溶于100ml重蒸水8ml抗凝、固定作用生理鹽水0.85%9ml等滲溶液GKN液NaCl8g、KCl0.4g、Na2HPO4·2H2O1.77gNa2HPO4、·H2O0.69g、葡萄糖2g、酚紅0.01g.溶于1000ml重蒸水中4～5ml模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，維持溶液PH值穩(wěn)定，著色細(xì)胞50%PEG液取PEG(MW4000)放入刻度離心管中，在沸水浴中加熱，使其熔化，待冷至50℃時(shí)，加入預(yù)熱50℃等體積的GKN液，混勻即可。0.5ml用于誘導(dǎo)細(xì)胞融合注意事項(xiàng):=1\*GB2⑴、胞融合對(duì)溫度的敏感很高，過高和過低的溫度都會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞融合，其溫度應(yīng)該控制在37℃～39℃范圍內(nèi)。=2\*GB2⑵、EG有毒性，此次實(shí)驗(yàn)對(duì)PEG的濃度要求很高，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)該選用分子量在1500～6000PEG的濃度以50%為好。=3\*GB2⑶、PH是該驗(yàn)細(xì)胞融合成功的關(guān)鍵，所以這次實(shí)驗(yàn)所配制的試劑PH應(yīng)控制在7.0～7.2。=4\*GB2⑷、在鏡檢觀察時(shí)候應(yīng)注意區(qū)別細(xì)胞融合與重疊的蟾蜍血紅細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：細(xì)胞核的分離與鑒定實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不同，用不同的轉(zhuǎn)速和不同的介質(zhì)離心，就可以將細(xì)胞內(nèi)各組分分級(jí)分離出來。本實(shí)驗(yàn)就是利用了細(xì)胞核的比重大小與細(xì)胞內(nèi)其他組分不同，先將組織制成勻漿，再在懸浮的均勻介質(zhì)中進(jìn)行離心，分離，甲苯胺藍(lán)又可以將細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，這樣，就可以鑒別分離出來的細(xì)胞核。預(yù)期結(jié)果：在顯微鏡下可見b切片中有藍(lán)紫色顆粒為細(xì)胞核教師：日期：實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備、器具表名稱規(guī)格、型號(hào)數(shù)量說明顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡1臺(tái)用于鏡檢離心機(jī)普通離心機(jī)1臺(tái)用于提取血細(xì)胞天平恒溫水浴箱1臺(tái)用于恒溫水浴加熱離心管50ml2支用于提取血細(xì)胞滴管膠頭1支用于粗略取用液體載玻片2.5cm*7.5cm2張用于制作涂片蓋玻片2cm*2cm2張用于制作涂片玻璃漏斗普通玻璃漏斗1個(gè)用于過濾量筒10ml1支用于量液燒杯25ml1個(gè)用于過濾解剖剪1只用于剪碎組織塊鑷子1只用于夾取組織塊紗布8層用于過濾玻璃勻漿器1只用于研碎組織塊染色盤1個(gè)用于染色實(shí)驗(yàn)試劑表名稱規(guī)格用量說明蔗糖-CaCl2溶液0.25mol/L蔗糖0.003mol/LCaCl28ml供能、保護(hù)生理鹽水0.85%9ml等滲溶液甲苯胺藍(lán)1%1ml染色實(shí)驗(yàn)步驟：處死：斷頭處死小鼠，手提尾部使腹內(nèi)血液盡量流出。取材：迅速開腹取肝，在盛有生理鹽水的小燒杯中反復(fù)洗滌，取濕重約1g的肝臟組織放在燒杯中。勻漿：加入8ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/LCaCl2中溶液于燒杯中，盡量剪碎組織，再將剪碎的組織放入玻璃勻漿器中進(jìn)行勻漿，勻漿器要處在低溫環(huán)境中，直到看不到明顯的組織塊為止。過濾：用8層紗布（生理鹽水或蔗糖溶液潤(rùn)濕的紗布）過濾勻漿液。離心：將過濾后的勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，再在天平上平衡每對(duì)離心管，2500r/min離心15min，取上清液于另一離心管中。剩下的沉淀和上清液和沉淀制成懸液。涂片：取上清