細胞培育培訓2021-6-12.常用設備

液氮罐、儲品柜〔存放雜物〕、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱〔-80℃〕、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺〔書寫實驗記錄〕。離心機〔搜集細胞〕、超凈任務臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱、水浴鍋、4℃冰箱.無菌室的滅菌

1.定期清掃無菌室：每周清掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈任務臺等，然后用3‰來蘇水或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱〔培育箱〕滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射.無菌室的滅菌

3.實驗前滅菌：翻開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.實驗后滅菌：用75％酒精〔3‰新潔爾滅〕擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。.實驗人員的無菌預備1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩。3.用75％酒精棉球擦凈雙手。.無菌操作的演示1.凡是帶入超凈任務臺內的酒精、PBS、培育基的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外外表2.接近酒精燈火焰操作。3.器皿運用前必需過火滅菌.無菌操作的演示4.繼續(xù)運用的器皿〔如瓶蓋、滴管〕要放在高處，運用時仍要過火。5.各種操作要接近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.汲取兩種以上的運用液時要留意改換吸管，防止交叉污染。.細胞培育用液的配制與消毒

細胞培育用水必需非常純真，不含有離子和其他的雜質。需求用新穎的雙蒸水、三蒸水或純真水.青、鏈霉素溶液的配制與消毒

1.

所用純真水〔雙蒸水〕需求15磅高壓20分鐘滅菌。2.詳細操作均在超凈臺內完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。3.運用時溶入培育液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克？.RPMI1640的制備與消毒1.溶解、調PH值、定容：先將培育基粉劑參與培育液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并參與培育基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝闡明添加一定的藥品.然后用注射器向培育基中參與配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。.RPMI1640的制備與消毒2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架銜接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。3.抽濾：配制好的培育液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈任務臺內過濾。4.分裝：將過濾好的培育液分裝入小瓶內置于4℃冰箱內待用。5.運用前要向100ml培育液中參與1ml谷氨酰胺溶液〔4℃時兩周有效〕。.血清的滅活

細胞培育常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經過過濾方可參與培育基中運用。.谷氨酰胺合成培育基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需求谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培育液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保管，用前參與培育液。加有谷氨酰胺的培育液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新參與原來的谷氨酰胺。.谷氨酰胺普通培育液中谷氨酰胺的含量為1～4mol/L?？梢耘渲?00mol/L谷氨酰胺液儲存，用時參與培育液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保管，運用時可向100ml培育液中參與1ml谷氨酰胺溶液。.細胞傳代培育〔消化法〕一.

傳代前預備：1.預熱培育用液：把曾經配制好的裝有培育液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈任務臺和雙手。3.正確擺放運用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4.點燃酒精燈：留意火焰不能太小。.細胞傳代培育〔消化法〕

5.預備好將要運用的消毒后的空培育瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。6.取出預熱好的培育用液：取出曾經預熱好的培育用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

7.從培育箱內取出細胞：留意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下察看細胞。

8.翻開瓶口：將各瓶口一一翻開，同時要在酒精燈上燒口消毒。.細胞傳代培育〔消化法〕吹打分散細胞1.吹打制懸：用滴管將曾經消化細胞吹打成細胞懸液。2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。4.棄上清液，參與新培育液：棄去上清液，參與2ml培育液，用滴管悄然吹打細胞制成細胞懸液。.細胞傳代培育〔消化法〕繼續(xù)培育：

用酒精棉球擦拭培育瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培育箱中繼續(xù)培育。傳代細胞2小時后開場貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培育瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。.細胞傳代培育〔消化法〕傳代細胞培育本卷須知：

1.嚴厲的無菌操作

2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、參與培育瓶中的量等諸多要素的影響，消化過程中應該留意培育細胞形狀的變化，一旦胞質回縮，銜接變松散，或有成片浮起的跡象就要立刻終止消化。.細胞的復蘇

細胞復蘇的原那么－快速融化：必需將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，防止冰晶緩慢融化時進入細胞構成再結晶，對細胞呵斥損害。.細胞的復蘇一.

實驗前預備：1.將水浴鍋預熱至37℃2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈任務臺臺面。

3.在超凈任務臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培育瓶等等。

.細胞的復蘇二．取出凍存管：

1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。.細胞的復蘇三．迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到曾經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。四.平衡離心：

用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min離心3min.細胞的復蘇五.制備細胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內參與10ml培育液，吹打制成細胞懸液。六.培育細胞

將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培育瓶內，將培育瓶放入37℃和5％CO2的培育箱內2-4小時〔或者24-48小時〕后換液繼續(xù)培育培育，換液的時間由細胞情況而定。.初學者易犯錯誤

1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延伸。3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞喪失。4.一次復蘇細胞過多，忘記改換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。.細胞的凍存1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。4.置于液氮罐中長期保管。5同時做好凍存記錄，在本人的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。.細胞的凍存本卷須知：1.運用DMSO前，不需求進